[發明專利]一種利用嗜熱引發酶擴增DNA的方法

有效

• 申請號: 201710153877.8
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN108624640B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 付鈺;趙德
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12P19/34;C12N9/12
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明涉及一種利用嗜熱引發酶擴增DNA的方法，屬于分子生物學技術領域。本發明的方法首先在反應體系中加入嗜熱引發酶A，所述嗜熱引發酶A為TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。高溫狀態下使雙鏈DNA分子變性，之后降低溫度合成RNA引物，再高溫，然后降至0℃靜置后，加入DNA聚合酶，一定溫度下延伸，可實現對長片段DNA的擴增，尤其適合全基因組DNA的擴增。本發明方法操作簡單，成本低，適用于擴增大片段或不規則DNA分子，進而用于全基因組測序，應用前景良好。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地，涉及利用嗜熱引發酶擴增DNA的方法。

背景技術

DNA擴增技術在現在的生物學研究中應用非常廣泛，PCR技術是利用嗜熱的DNA聚合酶，通過加入人工合成的DNA引物，經高溫退火，低溫變性，適溫延伸三個過程，完成對特定DNA片段的擴增。PCR技術目前已經得到了較大的發展，但由于目前技術的限制，對特定的DNA片段進行擴增，要得到擴增產物為特定長度和序列的DNA片段，最多只能做到對20kbp的片段進行擴增。對于一些長度更大的DNA片段(通常是全基因組DNA)進行擴增，目前常用的有MDA、MALBAC、DOP-PCR等方法，這些方法都通過加入人工合成的隨機DNA引物，以結合模板的任意部位，來實現對長度較長的模板DNA的整體擴增。擴增產物為大片段的不規則的DNA分子或者是不同長度DNA分子的混合物，這種產物通常用于全基因組測序。

傳統的全基因組擴增方法需要人工合成DNA引物加入到反應體系中。由于隨機引物本身存在的缺陷，傳統的擴增方法本身也存在一定的擴增偏好性，并會隨著擴增次數的增加，這種偏好性會積累，最終使擴增產物不均一，某些DNA片段被擴增的次數多，有些則可能較少。由于有多種DNA聚合酶也可以利用RNA作為引物來進行DNA的擴增，目前己經有報道用引發酶來合成RNA，DNA聚合酶以RNA作為引物，以代替隨機引物進行全基因組擴增的方法(pWGA)：T7pWGA利用T7噬菌體的gp4蛋白，在常溫下同時完 成解旋和引發兩個過程，并通過加入DNA聚合酶和單鏈結合蛋白，常溫下完成對DNA分子的擴增，但是該方法操作復雜，需要加入gp4、單鏈結合蛋白gp2.5、T7DNA聚合酶等多種蛋白，且gp4只在特定的DNA序列(3’-CTGG(G/T)-5’或3’-CTGTG-5’)處合成RNA引物，因此實用性相對較低，且序列特異性較高；T4pWGA是另外一種利用引發酶來進行DNA擴增的方法，此方法通過構建T4噬菌體復制子，體外純化了T4噬菌體復制子的全部8種蛋白，來實現對DNA的復制，但該方法需要使用的蛋白太多，因此只具有理論意義；近來也有報道用一種可以用DNA作為底物、同時具有較低的序列特異性的引發酶TthPrimPol進行擴增的方法，也獲得了較好的效果，但該方法使用的引發酶仍具有一定的序列特異性。

若能降低擴增引發序列的特異性，則能夠極大地擴大引發酶在DNA擴增領域的應用空間，但目前未見有使用引發酶非特異且高效擴增DNA的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述缺陷，提供一種利用嗜熱引發酶高效、低特異性地擴增DNA的方法。

為了達到這一目的，本發明提供的利用嗜熱引發酶擴增DNA的方法包括：(1)在反應體系中加入嗜熱引發酶，高溫狀態下使雙鏈DNA分子變性，

(2)降低溫度合成RNA引物，再高溫，

(3)然后降溫靜置后，加入DNA聚合酶，

(4)一定溫度下延伸，可實現DNA的擴增。

優選地，本發明所述嗜熱引發酶為嗜熱引發酶A，其為TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步驟(1)所述反應體系，其50μL反應體系中，樣品模板2.5pg～5ng，50mM pH7.5的HEPES，10mM DTT，100mM谷氨酸鉀，5mM 乙酸鎂，100μM NTP,500μM dNTP,1μM嗜熱引發酶A。