[發明專利]一種構建石榴品種身份證的方法及其應用

在審

• 申請號: 201710152549.6
• 申請日: 2017-03-15
• 公開（公告）號: CN106834505A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 牛娟;曹尚銀;李好先;張杰;陳利娜;劉貝貝;薛輝
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種構建石榴品種身份證的方法及其應用，具體地說，涉及一種利用SSR分子指紋和品種形態學特征特性等信息相結合，構建具有查詢功能的石榴SSR指紋網絡數據庫。

背景技術

石榴(Punica granatum L.)別名安石榴、若榴、丹若、天漿、涂林等，為石榴科(Punicaceae)石榴屬，落葉灌木或小喬木，原產于伊朗、阿富汗和高加索等中亞地區，在我國已有2000多年的栽培歷史，是中國近年來發展迅速的優良小雜果類果樹之一，目前形成了以新疆葉城、陜西臨潼、河南開封、安徽懷遠、山東嶧城和云南蒙自等為中心的主要栽培區域，它以其較高的經濟、營養、醫藥價值和保健功能，越來越受到消費市場的青睞。但由于異花授粉以及不同地域間的引種和品種交換，導致品種混雜、系譜不清，同物異名或同名異物現象嚴重。加之長期的無性繁殖和人類的偏好，使石榴基因型趨于單一，造成基因多樣性降低，品種退化等現象。目前，石榴種質資源的遠緣雜交已成為種質資源創新的一個重要途徑。因此，明確不同性狀品種的親緣關系及評價石榴種質的遺傳多樣性，對石榴種質資源的保護、高效育種與有效利用具有重要的科學意義。然而石榴育種工作中沒有一種準確有效的分子標記用于不同性狀品種的親緣關系及評價石榴種質的遺傳多樣性。國內外學者主要用形態學方法和分子標記技術對石榴進行研究。但形態學方法容易受季節和環境的影響，鑒定結果不準確。在分子水平上主要利用RAPD、AFLP、SRAP等技術進行石榴品種鑒定，而且多數集中在對某一地區的石榴品種進行研究，來源范圍較窄，涉及的品種數量少，不夠系統。因此，利用更穩定、更準確的分子標記技術鑒定石榴品種親緣關系及評價遺傳多樣性勢在必行。

而且隨著石榴種植面積迅速擴大，苗木品種混雜現象特別嚴重，給生產造成了極大的混亂。通過進行品種鑒定，可以對品種基本信息、品種分子身份證、品種間相似率和身份證核對等進行查詢，確保品種的真實性和純度，對優異石榴品種或材料實施產權保護具有十分重大的意義。同時還可指導雜交石榴品種真實性和純度鑒定，分析親本間遺傳相似性，為雜交石榴新組合的選育提供親本選配的參考。這對加快石榴良種化進程，促進產業發展，維護育種者和生產者的利益具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種構建石榴品種身份證的方法及其應用。

本發明的目的之一在于提供一種基于該SSR位點開發的一種與石榴品種鑒定及用于擴增該標記的引物對。

本發明的目的之二在于利用毛細管電泳SSR熒光標記分析，獲取石榴品種的指紋信息，將指紋信息與石榴的品種形態學特征特性等信息等相結合，構建石榴品種身份證及其在石榴新品種選育工作中的應用。

其具體技術方案為：

一種構建石榴品種身份證的方法，包括以下步驟：

步驟1、在苗期摘取不同石榴品種資源的葉片，用于DNA的提取；

采用改良CTAB法提取石榴新鮮葉片的DNA

(1)在65℃水浴中預熱提前配置好的2×CTAB提取緩沖液(0.1MTris-HCl、0.02M EDTA、1.4M NaCl、2％PVP、2％CTAB)；

(2)在液氮中研磨石榴葉片至粉末狀，轉至2.0mL離心管中；

(3)迅速加入2×CTAB提取緩沖液1.0mL，10μlβ-巰基乙醇，混勻，65℃水浴60min，隔10-15min顛倒搖勻一次；

(4)常溫下12000rpm離心5min，吸上清轉移至新的2.0mL離心管中；

(5)加入等體積的氯仿/異戊醇，充分混勻5min，放置5min，12000rpm常溫離心10min；

(6)吸上清到新的2.0mL離心管中，用氯仿/異戊醇重復抽提一次；

(7)離心，吸上清到新的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃放置2h，沉淀DNA；

(8)10000rpm常溫離心10min；

(9)倒掉異丙醇，用500μl乙醇洗沉淀兩次，吹干后用100μlTE溶解DNA；

(10)加入10mg/mlRNaseA2μl終濃度(200ng/ul)混勻，37℃保溫2h以上；

(11)加入500μlTE，再加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒搖勻2min；

(12)12000rpm常溫離心10min；

(13)吸上清到新的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃放置2h，沉淀DNA

(14)12000rpm常溫離心10min；