[發明專利]一種水蛭素的分離方法

在審

• 申請號: 201710147089.8
• 申請日: 2017-03-13
• 公開（公告）號: CN106928347A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 湯浩強
• 申請（專利權）人: 佛山市愛的生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/815
• 分類號: C07K14/815;C07K1/14
• 代理公司: 佛山市海融科創知識產權代理事務所(普通合伙)44377
• 代理人: 陳志超,羅尹清

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，主要涉及一種水蛭素的分離方法。

背景技術

血栓是導致心腦血管疾病發生的主要原因，而凝血酶是導致血栓形成的主要原因。水蛭素是迄今發現的最強的凝血酶特異性抑制劑，能與凝血酶特異性結合使之喪失凝血活力。目前，水蛭素主要以日本醫蛭、菲牛蛭、歐洲醫用水蛭、印度水蛭、亞馬遜巨型水蛭等為原料提取。臨床實驗表明，水蛭素既能使血栓融化從而消除或緩解病情，也能防止血栓形成，具有極好的預防和治療血栓性心血管疾病的效果。

目前，國內外提取水蛭素的方法有多種。例如1970年Markwardt采用的乙醇分級沉淀、陽離子交換、凝膠過濾以及陰離子交換等步驟獲得水蛭素。中國專利—醫用天然水蛭素的提取方法（申請號92107076）是將水蛭搗碎成漿狀，加熱，用冰醋酸調pH值，冷卻至室溫，用Na2CO3溶液調節pH值，離心收集濾液，沉淀用生理鹽水浸提2~3次，離心收集濾液，合并濾液，透析，透析液用乙醇沉淀，收集沉淀，低溫干燥的水蛭素。這些工藝存在提取步驟繁瑣、水蛭利用率低、水蛭素的活性低等問題。

因此，現有技術還有待于改進和發展。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種水蛭素的分離方法，旨在解決現有水蛭素的提取方法存在的提取步驟繁瑣、水蛭利用率低、水蛭素的活性低等問題。

本發明的技術方案如下：

一種水蛭素的分離方法，其中，包括以下步驟：

在水蛭的唾液或胃液中加入鹽水進行稀釋；

在37℃～100℃水浴加熱3～300min，使樣品的溫度加熱至36~38℃；

將樣品轉移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為5000~10000kDa；

將離心得到的濾液，靜置，取上清液；

對上清液進行冷凍干燥，得到水蛭素凍干粉。

所述的水蛭素的分離方法，其中，鹽水的添加量為唾液或胃液的總體積的0.4~20倍，鹽水的濃度為0.1~68%。

所述的水蛭素的分離方法，其中，所述鹽水采用生理鹽水。

所述的水蛭素的分離方法，其中，所述水浴加熱溫度設置為37~50℃。

所述的水蛭素的分離方法，其中，離心過程中，轉速1000~8000rpm，離心時間為1~100min。

所述的水蛭素的分離方法，其中，冷凍干燥過程，是在-40℃條件下，冷凍5h～100h。

有益效果：本發明的水蛭素的分離方法，步驟簡單，效率高，水蛭素的活性高，可以達到400U/g以上；只需采用水蛭的唾液或胃液即可完成水蛭素的分離，無需殺死水蛭，大大降低了分離成本，提高水蛭的利用率；完全不需要采用有毒的溶劑，只需采用生理鹽水即可完成分離，降低分離成本，同時保證藥物的純正，而且對環境無污染，適合工業化生產。

具體實施方式

本發明提供一種水蛭素的分離方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明所提供的水蛭素的分離方法，以水蛭的唾液或胃液為提取對象，水蛭可重復使用，大大提高水蛭的利用率并降低水蛭素的制作成本。而且，本發明所提供的分離方法，步驟簡單，水蛭素含量和活性高。

具體地，本發明所提供的水蛭素的分離方法，包括以下步驟：

稀釋：在水蛭的唾液或胃液中加入鹽水進行稀釋；

水浴加熱：在37℃～100℃水浴加熱3～300min，使樣品的溫度加熱至36~38℃；

濾膜離心：將樣品轉移至帶有濾膜的離心管中進行離心處理，濾膜的截留分子量為5000~10000kDa；

靜置：將離心得到的濾液，靜置，取上清液；

冷凍干燥：對上清液進行冷凍干燥，得到水蛭素凍干粉。

其中，在稀釋步驟中，采用鹽水對水蛭的唾液或胃液進行稀釋，使水蛭素便于分離。鹽水的添加量為唾液或胃液的總體積的0.4~20倍，鹽水的濃度可以為0.1~68%，優選地，所述鹽水采用生理鹽水。

在水浴加熱步驟中，是為了使樣品的溫度加熱至37.5℃左右，其加熱的作用也是為了使水蛭素便于分離。在水浴加熱的過程中，優選為對樣品進行攪拌，使樣品受熱均勻，提高分離效率。水浴加熱的時間和溫度根據實際環境溫度進行控制，環境溫度低或水浴溫度低則加熱時間長，環境溫度高或水浴溫度高則加熱時間短。優選地，為了保證樣品質量，所述水浴加熱溫度設置為37~50℃。