[發(fā)明專(zhuān)利]約安巨馬陸抗血栓肽Joannsin及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710144839.6
• 申請(qǐng)日: 2017-03-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106928334A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賴(lài)仞;欒寧;段自磊;嚴(yán)秀文;莫國(guó)香
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/435
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/435;C12N15/12;C12N15/10;A61K38/17;A61P7/02;A61P9/10
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司32224
• 代理人: 劉艷艷,董建林

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種約安巨馬陸(Prospirobolus joannsi)抗血栓肽Joannsin及其編碼基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白酶廣泛存在于從病毒、細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的所有生物中，并在許多生理反應(yīng)中起著重要的作用，例如食物消化、凝血、組織重建、免疫防御等，在這些生理過(guò)程中，蛋白酶調(diào)節(jié)著一系列胞內(nèi)和胞外的蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)。蛋白酶一旦被激活，將導(dǎo)致一系列迅速而不可逆的特異細(xì)胞反應(yīng)。盡管蛋白酶是機(jī)體生理反應(yīng)所必須的，但過(guò)量的蛋白酶對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)內(nèi)環(huán)境卻是一種潛在的危險(xiǎn)，所以蛋白酶抑制劑對(duì)生物的穩(wěn)態(tài)是不可缺少的，同時(shí)在許多有毒動(dòng)物中，蛋白酶抑制劑作為其捕食或者抵御捕食者中發(fā)揮著重要的作用。

目前，在自然界中共發(fā)現(xiàn)了四種蛋白酶抑制劑：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血因子X(jué)等的絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，抑制膠原酶、氨肽酶和嗜熱菌蛋白酶等的金屬蛋白酶抑制劑，及抑制組織蛋白酶D、逆轉(zhuǎn)錄蛋白酶和胃蛋白酶等的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，其中，絲氨酸蛋白酶抑制劑的種類(lèi)最多。根據(jù)序列同源性、半胱氨酸數(shù)目和分子中二硫鍵與作用位點(diǎn)之間的拓?fù)鋵W(xué)關(guān)系，絲氨酸蛋白酶抑制劑又分為Serpin、TIL(trypsin inhibitor like cysteine rich domain)、Kazal、Kunitz和Bowman-Birk等幾個(gè)家族。

凝血系統(tǒng)包括內(nèi)源途徑和外源性凝血途徑。內(nèi)源性凝血途徑：是指從因子Ⅻ激活，到因子X(jué)激活的過(guò)程。當(dāng)血管壁發(fā)生損傷，內(nèi)皮下組織暴露，帶負(fù)電荷的內(nèi)皮下膠原纖維與凝血因子接觸，因子Ⅻ即與之結(jié)合，在HK和PK的參與下被活化為Ⅻa。在不依賴(lài)鈣離子的條件下，因子Ⅻa將因子Ⅺ激活。在鈣離子的存在下，活化的Ⅺa又激活了因子Ⅸ。單獨(dú)的Ⅸa激活因子X(jué)的效力相當(dāng)?shù)停cⅧa結(jié)合形成1：1的復(fù)合物，又稱(chēng)為因子X(jué)酶復(fù)合物。這一反應(yīng)還必須有Ca²⁺和PL共同參與；外源性凝血途徑：是指參加的凝血因子并非全部存在于血液中，還有外來(lái)的凝血因子參與止血。這一過(guò)程是從組織因子暴露于血液而啟動(dòng)，到因子Ⅹ被激活的過(guò)程。內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑都是通過(guò)Ⅹa、凝血酶共同的凝血途徑完成最后的凝血過(guò)程；凝血途徑由各種凝血因子組成，許多凝血因子都是絲氨酸蛋白酶，所以絲氨酸蛋白酶抑制劑在抗凝血過(guò)程中可能會(huì)發(fā)揮一定的功能。

由于外源性凝血系統(tǒng)和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)都匯合于Ⅹa、凝血酶共同的凝血途徑，所以抗凝血抗血栓藥物選擇抑制Ⅹa、凝血酶看似是個(gè)絕佳的選擇，但是臨床結(jié)果表明，抑制Ⅹa、凝血酶這些共同的凝血途徑，長(zhǎng)時(shí)間用藥可能會(huì)導(dǎo)致凝血功能障礙，引起出血，所以通過(guò)靶向其他的凝血因子或許是個(gè)更好的選擇。

最近的研究表明通過(guò)靶向FXII抑制凝血過(guò)程，不會(huì)對(duì)血液系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，Infestin-4是到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的FXII抑制劑，研究表明其作為抗凝藥不會(huì)引起出血等；同時(shí)FXII的抗體也會(huì)產(chǎn)生抗血栓效應(yīng)而不會(huì)產(chǎn)生出血的風(fēng)險(xiǎn)。

蛋白酶抑制劑也廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌和病毒等生物體內(nèi)，通過(guò)發(fā)掘生物質(zhì)資源，并從生物中分離純化出針對(duì)于內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑中的凝血因子的蛋白酶抑制劑，在抗血栓藥物的研發(fā)中起著重要的作用。

馬陸(millipede)也叫千足蟲(chóng)、千腳蟲(chóng)、秤桿蟲(chóng)。馬陸屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，多足綱，倍足亞綱，體節(jié)組成。長(zhǎng)約20～35厘米，暗褐色，背面兩側(cè)和步肢赤黃色。目前已經(jīng)命名的有12000多種，估計(jì)全世界其有80000多種。從馬陸的基因組中可以發(fā)現(xiàn)有許多蛋白酶抑制劑，但是馬陸中的蛋白類(lèi)或者多肽類(lèi)活性分子目前還未見(jiàn)研究，所以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組學(xué)分析或許可以發(fā)現(xiàn)馬陸中個(gè)體防御功能的蛋白分子，使其遇見(jiàn)捕食者時(shí)不僅僅通過(guò)氣味還能夠通過(guò)這些多肽毒素來(lái)發(fā)揮抵御作用。我們首次從約安巨馬陸中識(shí)別了一個(gè)作用很強(qiáng)的FXa和trypsin抑制劑Joannsin。

本發(fā)明涉及的多肽Joannsin能夠抑制血栓形成。通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)它具有很強(qiáng)的抗血栓活性。將本發(fā)明的約安巨馬陸抗血栓肽Joannsin全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。將本發(fā)明的約安巨馬陸抗血栓肽Joannsin編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出一種約安巨馬陸抗血栓肽Joannsin及其編碼基因和應(yīng)用。