[發(fā)明專利]一種用米曲霉降解葉黃素制備煙用香料的方法

在審

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• 申請日: 2017-03-10
• 公開（公告）號: CN107227314A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 黨立志;段焰青;陳興;杜剛;劉娟;黃立斌;雷聲
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業(yè)有限責任公司
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;C12R1/69
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)53108
• 代理人: 謝嘉

技術領域

本發(fā)明屬于卷煙香精香料制備技術領域，具體是涉及一種利用特殊的米曲霉菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法。

背景技術

在煙草行業(yè)中，香精香料對卷煙產(chǎn)品的口味起著決定性作用。現(xiàn)今生產(chǎn)的香料、香精中約85％的產(chǎn)品是通過化學合成方法得到的。但是用化學法合成的香料不僅合成較困難、且大量使用會對人體健康造成影響。隨著人們生活水平的提高，對煙用香料的需求趨向于天然、健康、安全、營養(yǎng)和多功能性。

天然香精香料是高價值的精細化工產(chǎn)品，但由于原料有限、提取成本高，僅僅依靠從天然動、植物中提取天然香料，遠遠滿足不了卷煙香料市場的需求。利用微生物發(fā)酵技術可以制備香料或進行香料的轉(zhuǎn)化，在提高香料產(chǎn)品質(zhì)量的同時，還能夠節(jié)約能源、降低成本，因此，科技人員對于卷煙用香精香料的生物制取技術進行了不斷嘗試。

類胡蘿卜素是一大類在自然界廣泛分布的四萜類化合物，其降解的致香物質(zhì)包括β-紫羅蘭酮、β-大馬酮、和二氫獼猴桃內(nèi)酯等，因具有較低的感觀閾值，是許多香料的特征香味，這類香味物質(zhì)在天然材料中含量很低，且提取成本昂貴，近年來一些研究者嘗試通過酶或微生物體系模擬類胡蘿卜素的自然降解，以獲得新型香料。等以地絲菌屬菌株(Geotrichum sp.)和芽孢桿菌(Bacillus sp.)兩株菌混菌培養(yǎng)，降解葉黃素產(chǎn)生紫羅蘭酮和紫羅蘭醇等有煙草特征香味的物質(zhì)。Zelena等以來源于蒜頭狀小皮傘的過氧化物酶降解葉黃素得到降解葉黃素得到3羥基α-紫羅蘭酮和3羥基β-紫羅蘭酮。但現(xiàn)有技術的效果尚不理想，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的實際需要。

米曲霉(Aspergillusoryzae)在自然界廣泛分布，是一類產(chǎn)復合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，但關于用米曲霉降解葉黃素制備煙用香料的研究，在現(xiàn)有技術中尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種以特殊的米曲霉菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法。所得產(chǎn)品符合天然香料的要求，具有濃郁木香味，能夠與煙香形成良好的配伍。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)。

除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。

本發(fā)明從云南省紅河州陳化煙葉中分離了一株真菌YNCA 9804作為試驗菌種，對其進行了ITS序列分析，鑒定結(jié)果表明該細菌屬于曲霉屬，其分類命名為米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804，保藏號為CCTCC No：M2016654。

本發(fā)明所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804菌株的形態(tài)學特征為：菌落微膨大、疏松粉狀，中間淡黃綠色，邊緣白色，背面乳白色；菌絲體發(fā)達，菌絲不光滑，有隔多分枝；分生孢子梗粗糙或有麻點，孢子囊呈球形或半球形，孢子鏈著生于小孢子梗上。

本發(fā)明所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804菌株的分子鑒定特征為：測序結(jié)果在GenBank中進行同源性比對，提取相似度98％以上的序列，利用MEGA6.0軟件，以領域連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，YNCA9804與菌株Aspergillusoryzae strain ATCC 42149聚為一簇，同源性為100％，鑒定菌株YNCA9804為米曲霉(Aspergillusoryzae)。

利用所述米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804菌株降解葉黃素制備煙用香料的方法，包括以下步驟：

(1)將米曲霉菌株YNCA 9804置于斜面固體培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)葉黃素儲備液的制備：稱取5g葉黃素，溶于10mL的二氯甲烷中，待葉黃素徹底溶解后加入1g Tween-80進行乳化；在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發(fā)干，再加入100mL無菌蒸餾水混合均勻，得儲備液待用；

(3)降解葉黃素的產(chǎn)香發(fā)酵：

①將保存?zhèn)溆玫拿浊咕闥NCA 9804轉(zhuǎn)接到液體種子培養(yǎng)基中，搖床上28℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速為180r/min，得米曲霉種子液；所述的液體種子培養(yǎng)基：NaNO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，F(xiàn)eSO₄.7H₂O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5～6.8，裝入250mL錐形瓶，100mL/瓶，121℃，25min滅菌備用；