[發(fā)明專利]提高羊口瘡疫苗免疫原性的佐劑及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710138800.3
• 申請日: 2017-03-09
• 公開（公告）號: CN107050450A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮮思美;李鵬飛;馮將;劉嬡;李婷;張益;包細(xì)明;張素輝;許國洋
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K39/275;C12N15/79;C12N15/12;C12N15/66;A61P37/04;A61P31/20;A61P1/02
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所11308
• 代理人: 黎昌莉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高羊口瘡疫苗免疫原性的佐劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

羊口瘡(Orf)，又名羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎，是由羊口瘡病毒(Orf virus，0rfV)引起的綿羊和山羊急性、高度接觸性、嗜上皮性人獸共患傳染病，羊口瘡病毒為副痘病毒屬成員之一，基因組全長134～139kb，中央編碼區(qū)(ORFs009-111)較為保守。

感染羊口瘡病毒的羊以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征，不同地區(qū)分離的病毒抗原性不完全一致。感染羊口瘡病毒的羊生產(chǎn)性能下降，采食困難、消瘦并長期帶毒，給養(yǎng)羊業(yè)及飼養(yǎng)人員的健康帶來嚴(yán)重的危害。該病幾乎遍布全世界所有養(yǎng)羊的國家和地區(qū)，而且我國是該病流行嚴(yán)重的國家，每年感染ORFV的羊不少于500萬只。

羊口瘡病毒(ORFV)的成熟病毒粒子呈磚形或橢圓形毛線團(tuán)樣外觀，外層由較厚的囊膜包裹，與VACV相似也具有IMV、EEV等多種病毒粒子形式(Rziha et al.,2003)。臨床預(yù)防羊口瘡的主要手段是接種疫苗，常用的有滅活苗和細(xì)胞弱毒苗，但存在產(chǎn)生抗體水平較低，免疫保護(hù)期短，不宜大量生產(chǎn)、儲存的缺點(diǎn)。目前對該病尚無特效的治療方法，只能采取臨床外傷處置及支持療法，在防控上國內(nèi)外主要采取接種羊口瘡弱毒活疫苗進(jìn)行預(yù)防，但這種疫苗仍不能夠徹底消除和控制該病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此，創(chuàng)制安全、高效的新型疫苗勢在必行，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種提高羊口瘡疫苗免疫原性的佐劑及其制備方法和應(yīng)用，所述佐劑包括可以表達(dá)細(xì)胞因子IL-2的真核表達(dá)質(zhì)粒，能提高羊口瘡疫苗免疫原性，對新型羊口瘡疫苗的研究具有重要的意義。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

提高羊口瘡疫苗免疫原性的佐劑，所述佐劑包括真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2。

進(jìn)一步，所述真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2中含有山羊IL-2的全基因編碼序列，如SEQ ID NO:1所示。

提高羊口瘡疫苗免疫原性的佐劑，所述佐劑包括能表達(dá)IL-2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。

白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一種最早發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，它能刺激T、B細(xì)胞生長增殖，激活T細(xì)胞分泌IFN-γ、CSF等，并增強(qiáng)Tc(Cytotoxic T cel1)、NK、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，增強(qiáng)抗原提呈作用，是調(diào)節(jié)機(jī)體誘導(dǎo)免疫的重要細(xì)胞因子。由于它能夠有效地提高免疫功能，醫(yī)學(xué)上已用于預(yù)防和治療一些常規(guī)方法難以治療的疾病，如腫瘤等。

臨床預(yù)防羊口瘡的主要手段是接種疫苗，常用的有滅活苗和細(xì)胞弱毒苗，但存在產(chǎn)生抗體水平較低，免疫保護(hù)期短，不宜大量生產(chǎn)、儲存的缺點(diǎn)，不易大規(guī)模制備等原因而未能夠進(jìn)入臨床應(yīng)用。因此，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意義，山羊IL-2能夠有效地提高免疫功能，通過構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒作為DNA疫苗來預(yù)防羊口瘡能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，且核酸疫苗具有易于制備，具有重要的臨床意義。

pVAX1載體是用于核酸疫苗的研究較多的載體之一，是美國FDA認(rèn)可的可用于人的核酸疫苗研究的載體，其特征是攜帶強(qiáng)啟動子Pc-MV和BGH ploy A信號，允許在大腸桿菌中進(jìn)行高拷貝復(fù)制和在哺乳動物細(xì)胞中高水平瞬時(shí)表達(dá)的蛋白。pVAX1載體是在pcDNA3.1載體的基礎(chǔ)上改造而成，該載體使用卡那霉素抗性基因替代pcDNA3.1載體的氨芐抗性基因，減少和人類基因重組的可能。由于pVAX1載體是一種非融合載體，要求插入序列中5'端含一個(gè)Kozak序列、起始密碼子ATG和終止密碼子TGA/TAG/TAA，以增強(qiáng)目的基因表達(dá)效率。

進(jìn)一步，所述真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2的OD_260-280數(shù)值為1.8-2.0。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述的佐劑的制備方法，將IL-2基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pVAX1中，得基因真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2。

進(jìn)一步，所述的制備方法包括以下步驟：

1)提取山羊淋巴細(xì)胞中RNA，進(jìn)行PCR目的基因IL-2的擴(kuò)增；

2)將得到的IL-2基因與pMD19-T載體進(jìn)行連接，再經(jīng)轉(zhuǎn)化得重組質(zhì)粒；

3)采用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ對pVAX1載體和重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得IL-2基因目的片段和pVAX1載體片段；