[發明專利]一種pBpp蛋白及其功能驗證方法

在審

• 申請號: 201710137245.2
• 申請日: 2017-03-09
• 公開（公告）號: CN106967157A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 陳廷濤;辛洪波;王鑫
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/70;C07K1/14;C07K1/22;A61K38/16;A61P3/10
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技術領域

本發明涉及基因工程及蛋白純化技術領域，具體涉及一種pBpp蛋白及其功能驗證方法。

背景技術

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點。

目前，我國Ⅱ型糖尿病的患病率增長較快，據1979年在我國30萬人口中的調查，糖尿病患病率為0.6％，1989年為2.02％，年均增長0.1％左右，1994年我國普查20萬人口，患病率已上升為2.5％，目前20～75歲人群中糖尿病患病率約為3％左右。糖耐量低減患者不低于3％。一般而言，在我國富裕地區的糖尿病患病率高于貧困地區，城市高于農村，肥胖高于正常體重，高齡高于低齡。目前我國糖尿病發病率為1/1000左右，50歲以上的平均患病率為7％以上，40歲以下患病率隨著年齡的增長而升高，患者高峰年齡在50～70歲。

我國患病率以北京、遼寧、寧夏、甘肅、云南、福建較高，據1979～1997年調查結果表明為全國之首，而新疆、貴州、山西較低。發病率較高的北京、遼寧與最低的貴州、新疆之間相差達10倍，城市發病率高于農村1～4倍，廣西地區調查證明，產糖地區糖尿病患病率高于非產糖區2倍。

盡管多種治療方法可以控制血糖濃度，但目前仍未實現糖尿病的根治。現有技術中，藥物干預仍是糖尿病治療的主要手段，其中以GLP-1類似物、DPPIV抑制劑等應用較為廣泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cell proliferation protein)，是指可誘導胰腺中β細胞增殖、進而促進胰島素分泌的一類功能性蛋白，由于其不直接參與人體糖代謝機制，因此降糖作用較為溫和，對人體副作用較小。然而，此類蛋白的規模化生產是目前制約其臨床應用的直接技術問題，其中人源蛋白的獲取較為困難，而其他生物來源的pBpp蛋白其藥效及安全性又難以得到保障。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種pBpp蛋白及其功能驗證方法，以解決現有技術中pBpp蛋白難以規模化制備的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是以基因工程手段獲得的、由微生物所表達的重組pBpp蛋白，其純化較為困難。

本發明要解決的再一技術問題是現有技術中pBpp蛋白對哺乳動物血糖的調節效果難以得到準確的量化考察。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種pBpp蛋白，該pBpp蛋白是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執行PCR擴增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即為pBpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達基因，連接到pET28c載體上，即得到重組質粒pET28c-pBpp；

3)取步驟2)所得的重組質粒pET28c-pBpp，轉入大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌株；

4)培養步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質粒pET28c-pBpp，將其轉化入大腸桿菌E.coli BL21，即得到重組表達菌株pET28c-pBpp-BL21；

5)培養步驟4)所得的重組表達菌株pET28c-pBpp-BL21，收集菌體；

6)利用EQ Buffer重懸步驟5)所得菌體，超聲破碎，而后以10000rpm的轉速離心10min，取上清；取鎳珠，懸浮于EQ Buffer中，以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于EQ Buffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于EQ Buffer中，得到鎳珠懸液，將其加入至所述上清中，于4℃條件下保持2h，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，懸浮于Wash Buffer中，而后在旋轉混勻儀上常溫旋轉10min，而后以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于EQ Buffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀，重懸于EQ Buffer中，再以4000rpm的轉速離心15min，收集沉淀；

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫Buffer中，在旋轉混勻儀上常溫旋轉15min，以4000rpm的轉速離心15min，收集上清，再以4000rpm的轉速離心15min收集上清；