[發明專利]一種超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因及其應用

有效

• 申請號: 201710136463.4
• 申請日: 2017-03-09
• 公開（公告）號: CN106834312B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 劉金鋒;劉哲;李杰;姜曰水;魏貝貝;鞏志金;車程川;楊革
• 申請（專利權）人: 曲阜師范大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉麗

本發明涉及基因工程技術領域,特別涉及一種超氧化物歧化酶Cu,Zn?SOD基因，核苷酸序列如序列表中序列1所示，GLN49(CAG)突變為TRP(TGG)；GLY90(GCT)突變為ILE(ATA)。超氧化物歧化酶Cu,Zn?SOD基因在氧自由基清除中的應用。突變前后蛋白穩定性的比較，SOD突變后，分別在37℃，55℃水浴保溫一定時間后測酶活，穩定性都提高5?10倍，耐酸堿性能明顯提高，對蛋白酶和胰蛋白酶耐受性也明顯提高。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域,特別涉及一種超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因,還涉及此基因的應用。

背景技術

超氧化物歧化酶(SOD)是1938年首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開始算起，人們對SOD的研究已經有70多年的歷史，1969年由Fridovich和McCord發現其發生作用的機制是發生歧化反應，故正式命名為超超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)。SOD是一種自由基清除劑，廣泛存在于自然界一切生物體內，通過催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，減輕或者消除超氧陰離子對機體的氧化或過氧化損害。SOD是體內一種重要的氧自由基清除劑，還是一種應用廣泛的藥用酶。目前，SOD主要集中在治療關節炎、類風濕性關節炎、缺血再灌注綜合癥，具有顯著療效，此外在抗輻射、抗腫瘤和預防衰老起到了重要作用。因此，對人體不斷補充SOD具有抗衰老的特殊效果，已被廣泛應用于生物醫藥、保健品和化妝品等行業。

根據所含金屬離子的不同可以主要將SOD分為三類：①Cu,Zn-SOD:呈藍綠色，由兩個亞基組成，每個亞基含有Cu、Zn兩種金屬離子，每個亞基的分子量為16kD,主要存在于真核細胞的細胞質中,同時也是目前研究最多的一種SOD；②Mn-SOD:呈粉紅色，存在與哺乳動物的線粒體內以及原核生物中，哺乳動物的Mn-SOD主要由四個亞基組成；原核生物中則是由兩個亞基組成，每個亞基含有一個Mn離子，每個亞基的分子量為24Kd；③Fe-SOD：呈黃色，由兩個亞基組成，每個亞基含有一個Fe，主要存在于原核生物和少數植物細胞內。此外，還包括含有金屬Ni的Ni-SOD等。

但由于天然SOD作為一種酶用于臨床存在體內停滯時間短、半衰期只有6-8min,易于被蛋白酶水解，并且具有免疫原性等不利因素。因此，對SOD進行分子改造以改變分子的理化性質，增加對高溫和極端pH等的穩定性，克服上述不利因素就顯得十分必要。目前對SOD進行分子改造和化學修飾主要有兩條途徑。第一種采用聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐、肝素、殼聚糖等對SOD的氨基酸殘基進行化學修飾，主要是對其非活性部位進行修飾以提高其穩定性并仍能保留最大活性。第二種采用對SOD進行酶切改造以達到降低分子量和抗原性的目的。但是鑒于化學修飾不能實現定點修飾，而酶切改造的SOD在體內半衰期仍然很短。

CN101525600A公開了一種提高重組人Cu,Zn-SOD活性蛋白產量的方法，突變位點為人Cu,Zn-SOD蛋白的第6位和111位半胱氨酸殘基定點突變為親水性氨基酸殘基，使得裂菌上清中的重組蛋白占重組蛋白總體表達的比例由40％提高到80％，并且從上清中純化的突變體rhCu,Zn-SOD的比活性與上清中純化的未突變rhCu,Zn-SOD的相當。此方法只是提高了Cu,Zn-SOD產量，對活性及穩定性并沒有影響。

能夠提高rhCu,Zn-SOD的穩定性的突變，至今仍無相關記載。

發明內容

為了解決以上現有技術中Cu,Zn-SOD的穩定性差的問題，本發明提供了一種體內半衰期長、穩定性高的超氧化物歧化酶Cu,Zn-SOD基因。

本發明還提供了上述基因的應用。