[發(fā)明專利]一種新型定向制備內(nèi)切菊粉酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710136233.8
• 申請(qǐng)日: 2017-03-09
• 公開（公告）號(hào): CN106591260B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鑫;王偉;勇強(qiáng);賴晨歡;周瑾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12P19/14
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

一種新型定向制備內(nèi)切菊粉酶的方法，其特征在于，將菊粉溶于乙醇的水溶液中，充分混勻后，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0?5.0，加入微生物產(chǎn)天然菊粉酶，經(jīng)靜置后，離心得固形物，加入蒸餾水復(fù)溶固形物，即得僅含內(nèi)切菊粉酶活力的酶液。本發(fā)明方法可以高效拆分天然菊粉酶系中的內(nèi)切菊粉酶與外切菊粉酶，定向制備僅含內(nèi)切菊粉酶活力的酶液，用于水解菊粉制備低聚果糖。本發(fā)明大幅度提高酶解制備低聚果糖的得率，降低產(chǎn)品中對(duì)人體無(wú)特異性生理活性的單糖含量，為微生物產(chǎn)天然菊粉酶制備低聚果糖提供了高效、低成本的生產(chǎn)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程中微生物產(chǎn)酶制備低聚糖領(lǐng)域，特別涉及一種新型定向制備內(nèi)切菊粉酶的方法。

背景技術(shù)

菊粉，又稱菊糖，廣泛分布于自然界中，作為糖類儲(chǔ)存物大都存在植物當(dāng)中，例如菊芋、菊苣、大蒜、洋蔥等，它是一種植物多糖，是D-果糖的聚合物，是D-果糖以β(2-1)糖苷鍵連接而成的鏈狀多糖，在分子末端以β(1-2)鍵連接D-葡萄糖。菊粉的分子式具有GFn結(jié)構(gòu)(G：葡萄糖基，F(xiàn)：果基，n：果糖基的單位數(shù)目)。菊粉的聚合度范圍是2-60，平均分子量在5500左右。菊粉微溶于冷水，在熱水中能很快溶解，與碘不呈顏色反應(yīng)，無(wú)還原性，有旋光性，在水中為左旋。菊粉為白色或乳白色無(wú)定形粉末，是水溶性很好的膳食纖維。工業(yè)上一般是從菊芋中提取低聚果糖。

低聚果糖廣泛存在于各種植物中，在人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖澄镏校缇沼蟆⑾憬丁⒋笏狻⒎涿邸⒀笫[、小麥等中都有低聚果糖的存在，是優(yōu)良的水溶性膳食纖維，也是完全符合益生元標(biāo)準(zhǔn)的典型雙歧因子，同樣也是人體保健功能研究試驗(yàn)最為深入詳盡的寡糖之一，以其優(yōu)越的生理功能成為近十年來(lái)國(guó)際食品市場(chǎng)上廣泛流行的功能性食品配料。工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖一般是以下兩種方法：一是以蔗糖為底物在果糖轉(zhuǎn)移酶作用下獲得低聚果糖，產(chǎn)物為GFn型；二是以菊粉為底物在菊粉酶作用下獲得低聚果糖，產(chǎn)物為GFn和Fn型。在果糖轉(zhuǎn)移酶作用下，蔗糖會(huì)轉(zhuǎn)化成葡萄糖和低聚果糖，但是葡萄糖是果糖轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，所用以蔗糖為底物在果糖轉(zhuǎn)移酶作用下來(lái)獲得果糖的方法成本高，效率低。大部分工業(yè)上直接采用以菊粉為底物在菊粉酶作用下來(lái)制備低聚果糖。

菊粉酶是一類催化菊粉水解的復(fù)合酶類，它按其水解果糖苷鍵的方式不同，分為內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶兩類。外切菊粉酶作用于菊粉鏈果糖末端的糖苷鍵逐一水解釋放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要產(chǎn)物為果糖；內(nèi)切菊粉酶僅作用于菊粉，隨機(jī)斷開菊粉鏈內(nèi)部的糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要是菊粉型的低聚三糖、低聚四糖和低聚五糖。菊粉酶水解菊粉的機(jī)理是菊粉多糖首先在內(nèi)切菊粉酶從菊粉分子內(nèi)部隨機(jī)切斷β-2，1-呋喃果糖苷鍵，得到低聚果糖，接著外切菊粉酶從低聚果糖分子的非還原末端依次水解β-D果糖苷鍵，生成一分子果糖和少一個(gè)果糖分子的果聚糖，最終產(chǎn)物為果糖和葡萄糖。由菊粉酶酶解機(jī)理可以看出，如果菊粉酶系中外切菊粉酶的含量越低，則在水解過程中，由內(nèi)切菊粉酶作用得到的低聚果糖向葡萄糖、果糖方向轉(zhuǎn)化就越少，而低聚果糖最終的得率就會(huì)相應(yīng)的提高。而一般而言，在微生物分泌的菊粉酶酶系結(jié)構(gòu)中，外切菊粉酶比例高于內(nèi)切菊粉酶。

為了解決上述問題，獲得低外切菊粉酶活力的高內(nèi)切菊粉酶活力成為近年該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前多數(shù)具有工業(yè)化潛力的微生物分泌的菊粉酶，均含有較多的外切菊粉酶。低外切菊粉酶活力有利于制備低聚果糖，產(chǎn)生極少的果糖和葡萄糖。為了獲得低外切菊粉酶活力的內(nèi)切菊粉酶，國(guó)內(nèi)外研究中，較多采用色譜法制備內(nèi)切菊粉酶，但此類技術(shù)成本高，難于用于工業(yè)化生產(chǎn)。Nakamura等人(USP 4990451)報(bào)道利用兩步水溶性有機(jī)溶劑沉淀法從天然菊粉酶中制備內(nèi)切菊粉酶。該方法的機(jī)理是通過水溶性有機(jī)溶劑沉淀蛋白的方式，獲得含有內(nèi)切菊粉酶活力的沉淀蛋白，首先經(jīng)低濃度有機(jī)溶劑沉淀去除含有外切菊粉酶活力的蛋白，再調(diào)高有機(jī)溶劑濃度沉淀回收含有內(nèi)切菊粉酶活力的蛋白，內(nèi)切菊粉酶活力/外切菊粉酶活力的比值(I/S比)顯著提高。此方法是通過兩步過程，獲得含有內(nèi)切菊粉酶活力的沉淀蛋白，雖然I/S比較高，但沉淀蛋白中仍然含有外切菊粉酶活力。此外，還有報(bào)道采用物理、化學(xué)誘變或者基因工程方式改造微生物，得到突變菌株或者基因工程菌，達(dá)到只分泌內(nèi)切菊粉酶或者減少微生物分泌外切菊粉酶。

發(fā)明內(nèi)容