[發(fā)明專利]一種促進(jìn)茄子花粉胚增殖的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710134062.5
• 申請(qǐng)日: 2017-03-07
• 公開（公告）號(hào): CN106937594A
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊洋;田時(shí)炳;王永清;王之勁;鄒敏;連勇;劉富中;馮雨實(shí)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京國(guó)坤專利代理事務(wù)所(普通合伙)11491
• 代理人: 姜彥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)單倍體育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)茄子花粉胚增殖的方法。

背景技術(shù)

人工產(chǎn)生單倍體主要由花藥培養(yǎng)和小孢子(花粉)培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。經(jīng)自發(fā)加倍或人工誘發(fā)加倍，獲得純合可育的二倍體植株，使育種者可以選擇滿意的基因組合，為進(jìn)一步的育種和遺傳研究提供有用材料。愈傷誘導(dǎo)和胚狀體誘導(dǎo)是花藥和小孢子培養(yǎng)的兩種主要誘導(dǎo)途徑。愈傷誘導(dǎo)途徑是通過組培技術(shù)將處于一定發(fā)育階段的花粉誘導(dǎo)形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)一步形成無分化的薄壁組織即愈傷組織，再分化形成完整的植株。胚狀體誘導(dǎo)途徑是由花粉直接誘導(dǎo)分化形成胚狀體，胚狀體再直接分化形成的植株。愈傷誘導(dǎo)相對(duì)容易，可獲得再生率較高的再生植株。但由于花絲和包裹花粉的花藥壁屬于二倍體組織，因此通過愈傷誘導(dǎo)形成的再生植株的其倍性容易混雜，需要后期經(jīng)過大量的細(xì)胞學(xué)鑒定確認(rèn)植株的倍性后才能在實(shí)際應(yīng)用中得到應(yīng)用。在現(xiàn)有專利權(quán)的茄子花藥、小孢子培養(yǎng)操作中主要利用愈傷誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。花粉胚誘導(dǎo)可直接產(chǎn)生單倍體植株，省卻對(duì)其倍性進(jìn)行鑒定的步驟，節(jié)約大量的時(shí)間和精力。花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)均可以誘導(dǎo)花粉的胚狀體。小孢子培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)效率雖高于花藥培養(yǎng)，但其技術(shù)難度、操作要求和應(yīng)用成本均高于花藥培養(yǎng)，并且植株的再生率要低于花藥培養(yǎng)。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)花粉胚獲得單倍體植株的操作難度、應(yīng)用成本更低，但胚狀體的誘導(dǎo)效率低。在傳統(tǒng)的花藥培養(yǎng)過程中，導(dǎo)致花粉胚狀體誘導(dǎo)效率低的主要原因涉及營(yíng)養(yǎng)條件、激素配比、培養(yǎng)條件等各個(gè)方面。而提高花藥培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率需要大量的取樣、設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較，對(duì)多因素進(jìn)行調(diào)整以及篩選，并從花粉胚產(chǎn)生開始全過程跟蹤記錄每一個(gè)胚分化生長(zhǎng)的情況。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種促進(jìn)茄子花粉胚增殖的方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，通過在茄子花粉胚萌動(dòng)時(shí)調(diào)整外源激素的配比達(dá)到刺激多胚萌發(fā)的效果。試驗(yàn)證明調(diào)整胚分化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比濃度，可以提高花粉胚狀體的誘導(dǎo)頻率，由此獲得一種促進(jìn)茄子花粉胚增殖的方法，所述促進(jìn)茄子花粉胚增殖的方法采用胚增殖培養(yǎng)；

所述胚增殖將茄子花藥培養(yǎng)出胚狀體，待胚狀體肉眼可見，取出帶有胚狀體的單個(gè)花藥，移至胚增殖培養(yǎng)基中。胚增殖培養(yǎng)基：MS+0.01～0.05mg·L^-1NAA+1～2mg·L^-1KT+2％蔗糖+7g·L^-1瓊脂，pH 5.8；將單個(gè)胚狀體移至到再生培養(yǎng)基上再生植株；再生培養(yǎng)基：MS+3％蔗糖+7g·L^-1瓊脂，pH 5.8。

進(jìn)一步，所述胚增殖之前需要進(jìn)行：

(1)茄子花蕾選擇二薹花以上，發(fā)育正常，無表面損傷、花萼包裹緊密的花蕾，花冠或低或高于花萼裂基部1-2mm時(shí)；

(2)將采集到的適宜大小的花蕾用封口袋封閉，冰盒運(yùn)輸，并放入4℃冷藏室保存24-48h備用；

(3)茄子花蕾表面用70％酒精進(jìn)行消毒30s、無菌水清洗3次、1g·L^-1的HgCl₂加吐溫1滴浸泡7min、無菌水清洗5次，后用無菌紙吸干花蕾；從花蕾中剝?nèi)』ㄋ帲臃N于裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；

(4)將接種好的花藥放到暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行36℃，6～7d的熱激處理；

(5)經(jīng)高溫?zé)峒ぬ幚砗蟮幕ㄋ幏胖迷?5℃±1℃，光照強(qiáng)度1500-2500Lx，光照時(shí)間12-16h，濕度60％下培養(yǎng)5d，然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，之后每隔15-20d繼代一次；

進(jìn)一步，所述接種培養(yǎng)基：MS+0.2mg·L^-12,4-D+1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+4mg·L^-1AgNO₃+3％蔗糖+7g·L^-1瓊脂，pH 5.8。

進(jìn)一步，所述分化培養(yǎng)基：MS+0.1mg·L^-1KT+8mg·L^-1Vc+3％蔗糖+7g·L^-1瓊脂，pH 5.8。