[發(fā)明專利]體外誘導(dǎo)人的多能干細(xì)胞分化為精原干細(xì)胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710132920.2
• 申請日: 2017-03-07
• 公開（公告）號: CN107034178A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐輝明
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司31001
• 代理人: 翁若瑩,王婧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究領(lǐng)域，涉及一種體外誘導(dǎo)人的多能干細(xì)胞(包括人的胚胎干細(xì)胞，hESCs，和人的誘導(dǎo)型的多能干細(xì)胞，hiPSCs)分化為精原干細(xì)胞的方法，更具體地說，還涉及多能干細(xì)胞分化為精原干細(xì)胞及其在生殖中的研究及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人的精原干細(xì)胞(human Spermatogonial Stem Cells，hSSCs)在男人的一生中能夠一直啟動和維持男性生精的能力。然而，對于hSSCs的生物學(xué)特性及細(xì)胞內(nèi)如何控制hSSCs的自我更新與分化的機(jī)制還不太清楚。這主要是由于從人的睪丸組織中獲取hSSCs，存在來源稀少的實際困難和倫理學(xué)的問題。而眾所周知，人的多能干細(xì)胞(包括hESCs和hiPSCs)能分化為所有類型的細(xì)胞，包括生殖細(xì)胞，那樣就為基礎(chǔ)研究和臨床細(xì)胞治療提供來無限的和充足的細(xì)胞來源。另外一方面，在最近幾年來，許多未成年而患上了癌癥的男孩，經(jīng)過高劑量的放化療的治療后，能夠長期生存下來的人數(shù)不斷增加，但是一旦他們發(fā)育成年，卻要面對癌癥治療的副作用——不孕。而在將來，可能通過自體的hSSCs或自體體細(xì)胞重編程建立的iPSCs分化為hSSCs再移植到睪丸中，然后hSSCs在體內(nèi)分化產(chǎn)生精子，這樣可能解決這個問題。但也面臨著一個嚴(yán)峻的問題：沒有足夠多的hSSCs用于移植。基于以上背景，本發(fā)明探索了一種方法，將人的多能干細(xì)胞分化為hSSCs，這樣可以獲得足量的hSSCs用于基礎(chǔ)研究。另外，一方面，對于患上癌癥的未成年人，將來也可以通過自體體細(xì)胞重編程建立的iPSCs分化為hSSCs，再移植到睪丸中在睪丸產(chǎn)生精子，這樣可能解決不孕的問題。所以，將人的多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為hSSCs，再進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，將來可以用于基礎(chǔ)和臨床研究。。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種人的多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為精原干細(xì)胞的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種體外誘導(dǎo)人的多能干細(xì)胞分化為精原干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括：

步驟1：首先將人的多能干細(xì)胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在TeSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后在第一分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-15天，其中，前面4-6天在37℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后移到34℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-11天；

步驟2：將步驟1所得的細(xì)胞轉(zhuǎn)到第二培養(yǎng)基中，34℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8天；

步驟3：將步驟2中的第二分化培養(yǎng)基換成第三分化培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)在34℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8-天。

優(yōu)選地，所述的第一分化培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基a-MEM，0.88μM硬脂酸(stearic acid)，60μM腐胺(putrescine)，2.36μM棕櫚酸(palmitic acid)，0.21μM棕櫚油酸(palmitoleic acid)，2.71μM亞油酸(Linoleic acid)，1.02μM油酸(oleicacid)和0.43μM亞油酸(linolemic acid)。

更優(yōu)選地，所述的第一分化培養(yǎng)基還包括10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)，10mMHepes，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，50mM β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，0.2％牛血清白蛋白(BSA)，5μg/ml胰島素(insulin)。

更優(yōu)選地，所述的第一分化培養(yǎng)基還包括20ng/ml重組人的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和1ng/ml重組人的堿性成纖維生長因子(bFGF)。

優(yōu)選地，所述的第二分化培養(yǎng)基包括advanced DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，2％胎牛血清(FBS)，5ng/ml GDNF，2μM全反式維甲酸(retinoic acid，RA)，和50ng/ml干細(xì)胞因子(SCF)。

優(yōu)選地，所述的第三分化培養(yǎng)基包括advanced DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，4ng/ml GDNF，0.1μg/ml睪酮(testosterone，TTE)，8μg/ml維生素C(Vc)3U/ml維生素A(VA)，0.2g/ml維生素E(VE)和0.1U/ml重組人的卵泡刺激素(rhFSH)。

優(yōu)選地，所述的飼養(yǎng)層細(xì)胞可通過小鼠的胚胎經(jīng)分離培養(yǎng)得到。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：