[發(fā)明專利]體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710132920.2
• 申請日: 2017-03-07
• 公開（公告）號: CN107034178A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐輝明
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司31001
• 代理人: 翁若瑩,王婧

1.一種體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法，其特征在于，包括：

步驟1：首先將人的多能干細胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細胞上或在TeSR培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后在第一分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8-15天，其中，前面4-6天在37℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后移到34℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-11天；

步驟2：將步驟1所得的細胞轉(zhuǎn)到第二培養(yǎng)基中，34℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8天；

步驟3：將步驟2中的第二分化培養(yǎng)基換成第三分化培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)在34℃，5％CO₂濃度下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-8天。

2.如權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法，其特征在于，所述的第一分化培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基a-MEM，0.88μM硬脂酸，60μM腐胺，2.36μM棕櫚酸，0.21μM棕櫚油酸，2.71μm亞油酸，1.02μM油酸和0.43μM亞油酸。

3.如權(quán)利要求2所述的體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法，其特征在于，所述的第一分化培養(yǎng)基還包括10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，10mMHepes，2mM L-谷氨酰胺，50mMβ-巰基乙醇，0.2％牛血清白蛋白，5μg/ml胰島素。

4.如權(quán)利要求2所述的體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法，其特征在于，所述的第一分化培養(yǎng)基還包括20ng/ml重組人的膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和1ng/ml重組人的堿性成纖維生長因子。

5.如權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法，其特征在于，所述的第二分化培養(yǎng)基包括advanced DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，2％胎牛血清，5ng/ml GDNF，2μM全反式維甲酸，和50ng/ml干細胞因子。

6.如權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)人的多能干細胞分化為精原干細胞的方法，其特征在于，所述的第三分化培養(yǎng)基包括advanced DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，4ng/ml GDNF，0.1μg/ml睪酮，8μg/ml維生素C，3U/ml維生素A，0.2μg/ml維生素E和0.1U/ml重組人的卵泡刺激素。