[發(fā)明專利]一種玉米赤霉烯酮單克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710124541.9
• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN106950375B
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李成洪;龍定彪;宋青龍;唐紅梅;唐達;傅巍;張海燕;李悅
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶市畜牧科學(xué)院;北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/14;G01N33/577
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11368
• 代理人: 張海燕

1.一株雜交瘤細胞，其特征在于，能夠分泌高靈敏度和特異性的玉米赤霉烯酮單克隆抗體，保藏編號為CGMCC No.13281。

2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞克隆得到的玉米赤霉烯酮單克隆抗體。

3.一種玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒中含有由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞克隆得到的玉米赤霉烯酮單克隆抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：提取液、稀釋液和檢測卡，其中，

所述提取液為60v/v％甲醇水溶液；

所述稀釋液為0.02M、pH7.4的磷酸鹽緩沖液；

所述檢測卡由PVC底板(1)、樣品墊(2)、膠體金結(jié)合墊(3)、吸水濾紙(4)和NC膜(5)組成，NC膜(5)粘貼在PVC底板(1)的中段，吸水濾紙(4)粘貼在PVC底板(1)的上段，并且吸水濾紙(4)的下端部壓住NC膜(5)的上端部，膠體金結(jié)合墊(3)和樣品墊(2)均粘貼在PVC底板(1)的下段，并且膠體金結(jié)合墊(3)的上端部壓住NC膜(5)的下端部、樣品墊(2)的上端部壓住膠體金結(jié)合墊(3)的下端部，其中，

所述膠體金結(jié)合墊(3)做了如下處理：

取1mL濃度為0.01％的膠體金溶液并調(diào)節(jié)pH值至9.0，將由保藏編號為CGMCC No.13281的雜交瘤細胞克隆得到的玉米赤霉烯酮單克隆抗體按照3μg/mL標記，然后用終濃度1wt％BSA封閉，離心去上清液后用PBS洗滌一次，再次離心后用300μL膠體金重懸液懸浮，按10μL/cm噴金量將標記好的玉米赤霉烯酮單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊(3)上，37℃干燥2h；

所述NC膜(5)是通過如下方法制備得到的：

將玉米赤霉烯酮偶聯(lián)BSA稀釋到0.1mg/mL，按1μL/cm劃膜量包被到硝酸纖維素膜上檢測線T位置，將羊抗鼠IgG稀釋到0.1mg/mL，按1μL/cm劃膜量包被到硝酸纖維素膜上質(zhì)控線C位置，37℃干燥1h，組裝大板、切條，即得NC膜(5)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒，其特征在于，所述吸水濾紙(4)和NC膜(5)、膠體金結(jié)合墊(3)和NC膜(5)、樣品墊(2)和膠體金結(jié)合墊(3)的搭接寬度均為1mm-2mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒，其特征在于，所述膠體金溶液的制備方法為：

在圓底燒瓶中加入1L超純水，加熱，煮沸后加入10mL 1％氯金酸溶液，2min后加入12mL1％檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸15min后停止加熱，冷卻至室溫，即得膠體金溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備方法為：

用玉米赤霉烯酮偶聯(lián)OVA做為免疫原免疫雌性BALB/c小鼠，第三次免疫后選擇血清效價大于或等于1:4.2×10⁵的小鼠制備免疫細胞懸液，然后將免疫細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，融合后加入已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37℃、含5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接下來對雜交瘤細胞株進行培養(yǎng)、篩選和擴大培養(yǎng)，得到保藏編號為CGMCC No.13281的雜交瘤細胞，最后將該雜交瘤細胞注入小鼠腹腔中，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備單克隆抗體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮單抗制備完畢后需要純化，純化的方法為：

先采用二氧化硅吸附法預(yù)處理腹水，然后采用辛酸－硫酸銨沉淀法或者親和層析法純化IgG。

9.利用權(quán)利要求4所述的玉米赤霉烯酮定性檢測試劑盒定性檢測玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：稱取5±0.05g樣本到50mL離心管中，加入20mL提取液，振蕩提取3min-5min；

Step2：于4000rpm離心5min，取上清液40μL，根據(jù)檢測限加入適量稀釋液，得到待測液；

Step3：在20℃-30℃環(huán)境下，將檢測卡平放在桌面上，用滴管垂直滴加3滴待測液至加樣孔中，10min-15min內(nèi)觀察結(jié)果。