[發明專利]用于檢測結直腸癌相關基因多位點甲基化試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201710121118.3
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106893777B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張良祿;董蘭蘭;姚希輝
• 申請（專利權）人: 武漢艾米森生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明公開了用于檢測結直腸癌相關基因多位點甲基化試劑盒及應用，本發明提供的引物組合、探針能特異性地檢測出多個結直腸癌相關基因位點的甲基化程度。本發明還提供檢測甲基化的引物組合、探針在結直腸癌、癌前息肉篩查中的應用及其方法。包括如下步驟：將細胞沉淀中加入細胞裂解液充分混勻，然后加入PVPP進行粗提，初步處理后的細胞沉淀樣品中還有少量蛋白和RNA，再加入蛋白酶K和RNA酶完全除掉蛋白和RNA，將細胞裂解物加入帶有吸附膜的離心柱中，經過DNA漂洗液洗滌雜質后，再加入DNA洗脫液將DNA從吸附膜中洗脫下來，最后離心收集得到DNA溶液。針對多個基因位點進行高效的合管檢測，提高了靈敏度和特異度，能夠滿足腫瘤早篩的要求。

技術領域

本發明涉及醫療技術領域，尤其涉及用于檢測結直腸癌相關基因多位點甲基化試劑盒及應用。

背景技術

結直腸癌是世界第三大惡性腫瘤。中國近年來結直腸癌發病率逐年上升，估計每年約有40萬新發病例，在我國消化系統惡性腫瘤中位列第二。早期結直腸癌患者手術5年生存率可高達90％以上，中、晚期患者5年生存率僅10％左右，而臨床診斷的結直腸癌約80％為中晚期，這是導致其死亡率居高不下的關鍵因素之一。而經有效治療的早期結直腸癌患者其發病率降低60％，病死率降低80％，因此結直腸癌的早期發現、早期診斷及早期治療顯得尤為重要。

現有研究表明，結直腸癌的早期發生與結直腸癌相關基因啟動子區域的甲基化存在很大關系。甲基化是一種表觀遺傳修飾，其異常變化可引起DNA構象及DNA與蛋白質相互作用方式等發生改變，從而控制基因表達，因此與結直腸癌的早期發生關系緊密。現有專利CN 105543354A通過用磁珠捕獲人糞便DNA，再將其進行亞硫酸氫鹽處理，最后用PCR檢測SDC2基因啟動子區域甲基化情況。

該方法存在的問題和缺點：

1.該法所檢測的基因單一，雖然靈敏度比較高，但特異度不夠。本發明發現多個基因啟動子甲基化與結直腸癌發生相關，并且針對多個基因位點進行聯合檢測，提高了靈敏度和特異度，能夠滿足腫瘤早篩的要求。

2.該法對目的基因DNA片段的捕獲有局限性，只能捕獲磁珠特異片段的序列，無法對多個基因位點進行檢測。本發明獨創的糞便DNA提取技術和試劑盒，能夠獲得高純度高質量的基因組DNA，方便進行后續檢測。

因此，提出了用于檢測結直腸癌相關基因多位點甲基化試劑盒及應用。

發明內容

本發明提出了用于檢測結直腸癌相關基因多位點甲基化試劑盒及應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

用于檢測結直腸癌相關基因多位點甲基化試劑盒及應用，將糞便樣本置于基因組提取試劑盒中進行處理，其步驟如下：

A1、將樣本加入核酸裂解液液中充分混勻，然后加入PVPP進行粗提，去除掉大量雜質，如色素、蛋白質；

A2、初步處理后得到的核酸樣品中還有少量蛋白和RNA，再加入蛋白酶K和RNA酶完全除掉蛋白和RNA；

A3、將核酸樣品加入帶有吸附膜的離心柱中，用DNA漂洗液反復漂洗離心，再加入DNA洗脫液將DNA從吸附膜中洗脫下來，離心收集DNA溶液。

將所得純化后的DNA用本發明公開的亞硫酸氫鹽轉換試劑盒進行CT轉換，所述試劑盒包括溶解緩沖液、甲基化轉換試劑、結合緩沖液、漂洗緩沖液。

針對結直腸癌相關基因NDRG4、SDC2、TFPI2、BMP3的啟動子區域甲基化的特異性引物對、探針，針對多個基因啟動子甲基化位點進行高通量合管檢測。