[發明專利]一種準確檢測葉綠體轉化同質化程度的方法

有效

• 申請號: 201710120326.1
• 申請日: 2017-03-02
• 公開（公告）號: CN106755537B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 段康;張晨;趙娟;張業勝;董揚
• 申請（專利權）人: 云南納博生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.一種準確檢測葉綠體轉化同質化程度的方法，其特征在于，

所述方法將導入有外源基因-質粒載體的葉片經過培養基培養后得到陽性愈傷組織，選取質粒載體上的基因作為目的基因，選取葉綠體基因組上的基因作為內參基因，設計多對目的基因的引物和多對內參基因引物，進行預實驗篩選出適宜的目的基因和內參基因引物，然后提取陽性愈傷組織的全基因組DNA作為模板DNA，再進行熒光定量PCR實驗，采用熔解曲線確定有效數據，驗證擴增效率，計算得出葉綠體轉化同質化百分比，從而得到葉綠體轉化后的同質化程度；

所述目的基因為質粒載體上aadA基因的部分片段，所述內參基因選自煙草葉綠體基因組上的ycf2基因的部分片段；

篩選出的目的基因aadA的引物為目的基因引物1，所述目的基因引物1對應目的條帶序列1；

所述目的基因引物1如下：

前引物RT-aadA-F1：CCTTTTGGAAACTTCGGCTT；

后引物RT-aadA-R1：AAGATAGCCAGATCAATGTCG；

所述目的條帶序列1如下：

CCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTT；

篩選出的內參基因ycf2的引物為內參基因引物1，所述內參基因引物1對應內參目的條帶序列1；

所述內參基因引物1如下：

前引物NC-F1：GTCATTTGATCCAATAGCGTTC；

后引物NC-R1：CTGGTTTATCAAGAATACGCAAG；

所述內參目的條帶序列1如下：

GTCATTTGATCCAATAGCGTTCCGTTAGATAGGAACAGATTTGATAAATACTGATAACTCTCGGATAGAGTATTAGAACGGAAAGATCCATTAGATAATGAACTGTTGGTTCTAAGCCATCTCTGACGATTAATCAACAATTCGAAGTGCTTTTCTTGCGTATTCTTGATAAACCAG。

2.如權利要求1所述的準確檢測葉綠體轉化同質化程度的方法，其特征在于，所述預實驗篩選出適宜的引物過程中，使用20~25μL普通PCR反應體系，PCR反應的退火溫度為54℃~60℃，PCR反應后進行凝膠電泳，使用2%~3%高濃度膠回收目的條帶序列。

3.如權利要求1所述的準確檢測葉綠體轉化同質化程度的方法，其特征在于，熒光定量PCR時熔解曲線為單峰，表明檢測數據可靠有效；擴增效率應在98~102%之間，如果內參基因標準曲線的斜率與目的基因的斜率差在0.001~0.02之間，證明內參基因與目的基因擴

增效率相近，表明內參基因合適。

4.如權利要求1所述的準確檢測葉綠體轉化同質化程度的方法，其特征在于，熒光定量PCR實驗體系是20~25μL，加入0.2~0.5μL的RoxReferenceDye來校正孔與孔之間的誤差，提取的全基因組DNA按照1：10、1：100、1：1000、1：10000連續稀釋作為模板DNA，每個稀釋比做3~4個重復，同時對內參基因和目的基因定量。

5.如權利要求1所述的準確檢測葉綠體轉化同質化程度的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR檢測過程中PCR反應程序，退火階段：56~58℃，20~30s；延伸階段70~72℃，15~30s，循環40次；獲得標準曲線下的Ct值數據及熔解曲線后，熔解曲線為單峰表明數據可靠性強，利用△ct法，△ct法公式如下： 表達水平=2^-△ct，計算出成功轉入目的基因的葉綠體基因拷貝占所有葉綠體基因組拷貝的百分比。

6.如權利要求1~5任一所述的檢測葉綠體轉化同質化程度的方法，其特征在于，所述陽性愈傷組織提取全基因組DNA過程如下：（1）在超凈工作臺將愈傷組織切割成小塊放入滅菌的離心管中，然后使用研磨棒在離心管里將樣品磨碎；（2）磨碎后的樣品按照高效植物基因組DNA提取試劑盒的方法提取全基因組DNA，最大限度的保護DNA的完整性；（3）提取的全基因組在0.8%~1.2%的凝膠電泳上獲得的條帶需為單一條帶，且條帶片段大小在10k以上，則獲得的全基因組DNA作為模板DNA，并測DNA濃度；若獲得的條帶有拖帶現象，則不建議作為模板DNA。