[發明專利]一種ampC基因的實時熒光定量PCR快速檢測系統

在審

• 申請號: 201710118279.7
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN107012206A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 李盛;劉贊贊
• 申請（專利權）人: 濟寧神康生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司37205
• 代理人: 許靜

技術領域

本發明涉及一種ampC基因的實時PCR快速檢測系統，屬于實時PCR應用技術領域。

背景技術

耐藥菌的危害已遍及全球，耐藥性問題成為世界性的新的研究熱點。自從第一個抗生素——青霉素發現以來，人類研制、開發了多種抗菌藥物，成功地控制和治療了由細菌引起的感染性疾病。然而，隨著抗生素的不斷應用，細菌的耐藥性問題越來越突出，越來越嚴重。2000年6月12日路透社報道世界衛生組織的觀點：假若人們繼續濫用抗生素，對一切藥物產生抵抗的“超級細菌”將把人類帶回到舊時代，一些小小的感染也會使人喪命。耐藥菌產生之快、傳播之迅速、耐藥率之高引起世界性廣泛關注。耐藥菌的危害十分嚴重，它不僅使藥物療效減弱，藥物劑量極大，療程延長，復發率升高，治療費用增加，有時還引起并發癥，某些情況下甚至會使抗生素失去療效導致病人死亡率升高。細菌耐藥性的出現和耐藥細菌的感染常使經驗型治療難以奏效，給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰。因此，及時準確地檢測細菌的耐藥性，對細菌耐藥性的變遷和某些重點的耐藥細菌進行長期的監測和分析，可為臨床抗感染治療方案的擬定提供有益幫助。

在臨床病原菌的各種耐藥問題中，以青霉素和頭孢菌素為代表的β-內酰胺類抗生素的耐藥問題尤其突出，給臨床治療感染性疾病帶來極大困難。β- 內酰胺類抗生素是現有的抗生素中使用最廣泛的一類，它系指化學結構中具有β-內酰胺環的一大類抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青霉烯類、單環β-內酰胺類。β-內酰胺類抗生素通過抑制細菌胞壁的粘肽合成酶，阻礙細胞壁的合成而起到殺菌作用。針對β-內酰胺類抗生素，細菌在進化與繁殖過程中也產生了一套防衛機制，其中最重要的方式是產生β- 內酰胺酶。β-內酰胺酶可以水解β-內酰胺環中的酰胺鍵，使之轉化成為無活性的衍生物而失去殺菌作用，這是革蘭陰性桿菌耐β-內酰胺類抗生素的主要機制。

β-內酰胺酶種類繁多、特性各異，目前已發現的β-內酰胺酶超過300 種，其中頭孢菌素酶(AmpC酶)是臨床較為常見的β-內酰胺酶，具有重要的檢測意義。質粒AmpC酶高水平持續表達，且可通過轉化、接合等方式轉移給其它菌種，造成耐藥性的廣泛傳播。目前，在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌屬中都已發現質粒介導的AmpC酶。質粒AmpC酶危害嚴重，這是因為一種質粒可同時攜帶多個耐藥基因，使得產 AmpC酶的菌株表現出多重耐藥性，而且耐藥譜呈現擴大趨勢。另一方面，質粒的可傳遞性，使耐藥問題越來越嚴峻，容易引起醫院感染的暴發流行。

要減緩和控制耐藥菌株的產生，建立一種可靠的檢測方法是關鍵，而如何快速、準確的檢測質粒介導的AmpC酶是目前臨床實驗室面臨的一個普遍難題。目前用于實驗研究和臨床檢測的常見方法主要有以下幾種：頭孢西丁紙片法、頭孢西丁三維試驗、等點聚焦電泳/抑制試驗和基因檢測方法。前三種方法是利用耐藥表型篩選法或抑制劑篩選法對AmpC酶進行檢測，其缺點是耗時、特異性差、操作繁瑣、檢測結果易受環境因素影響，所以假陽性率高。基因檢測方法可以有效彌補表型檢測的缺點，目前使用比較多的是傳統PCR 方法和DNA芯片方法。傳統PCR方法根據質粒ampC基因的同源性設計群特異性引物，通過PCR對質粒ampC基因進行擴增。但該方法需要對PCR產物進行電泳分析，開管操作易產生氣溶膠污染，導致假陽性結果出現。DNA芯片方法通過PCR過程對擴增產物進行標記，若標記的產物與DNA芯片上的探針發生雜交，即可證明有耐藥基因的存在。DNA芯片技術雖然在檢測通量上有很大優勢，但卻需要PCR擴增、雜交、洗脫、檢測熒光等一系列操作步驟，而且成本高，難以在臨床實驗室推廣。由于上述種種原因，很多臨床實驗室很難準確及時的檢出質粒介導的AmpC酶。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種ampC基因的實時熒光定量PCR快速檢測系統，具體涉及質粒ampC基因的檢測。本發明可以有效彌補現有檢測方法的不足。本發明提供了一種簡便、準確的檢測質粒ampC基因的快速檢測系統。本發明的技術方案如下：

一種ampC基因的實時熒光定量PCR快速檢測系統，其中，分子信標探針是一種含有“莖-環”結構，分子信標探針的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；

本發明的特異性引物為：

上游引物F：5’-ATAGTATTGGAATACGTTATTA-3’；

下游引物F：5’-TATGCACTAGAATATGAGTC-3’。