[發明專利]提取原油總脫氧核糖核酸的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201710116846.5
• 申請日: 2017-03-01
• 公開（公告）號: CN106754895B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 萬云洋;穆紅梅;洪寧;顧雪瑩;田燕
• 申請（專利權）人: 中國石油大學(北京)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾;姚亮

1.提取原油總脫氧核糖核酸的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)對原油預處理；當所述原油為輕質原油時，采用異辛烷或三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液進行預處理；當所述原油為中質原油、重質原油或特重質原油時，采用異辛烷進行預處理；所述的預處理包括在原油中加入等體積異辛烷或TE緩沖液，再加入玻璃珠，渦旋，充分研磨成勻漿，裝入離心管后離心，棄去上清液，保留離心管底部的沉淀；

(2)采用陽-陰表活劑法裂解經預處理后的原油中的活細胞和/或死細胞，得含總脫氧核糖核酸的上清液；其中，陽-陰表活劑法裂解活細胞和/或死細胞包括如下步驟：在步驟(1)預處理后的樣品中加入質量體積比1g:20～40μL的濃度為10～20mg/mL溶菌酶，振蕩，加入質量體積比為1g:2～4mL的濃度為5～20mg/mL的含十六烷基三甲基溴化銨的DNA提取緩沖液，及質量體積比為1g:20～40μL的濃度為5～20mg/mL朊酶k，振蕩，再加入質量體積比為1g:0.2～0.4mL的濃度為100～200mg/mL的十二烷基硫酸鈉溶液，樣品加熱至50～65℃維持1h～2h，冷卻至20～25℃后離心收集上清液；所述質量體積比均是相對于所述預處理后的樣品；

(3)利用氯仿-醇沉淀、苯酚/氯仿-醇沉淀、氯仿-純化柱及苯酚/氯仿-純化柱4種純化方法之一從所述上清液中提取得到總脫氧核糖核酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，4種純化方法中采用含氯仿或苯酚/氯仿的有機溶劑除去步驟(2)上清液中的朊，其包括如下步驟：將步驟(2)中所得上清液與等體積的所述含氯仿或苯酚/氯仿的有機溶劑混合，10～30℃條件下，離心去除含朊沉淀；

其中，在除去步驟(2)上清液中朊后，氯仿-醇沉淀或苯酚/氯仿-醇沉淀純化方法還包括：移取采用含氯仿或苯酚/氯仿的有機溶劑除去步驟(2)中朊的上清液至等體積的異丙醇或兩倍體積無水乙醇中，充分混勻放入4℃冰箱8～12h，離心后棄去上清，并加入預冷的70％乙醇洗滌，在空氣中充分干燥后加入滅菌超純水，渦旋混勻；

其中，在除去步驟(2)中朊后，氯仿-純化柱或苯酚/氯仿-純化柱純化方法還包括：移取采用含氯仿或苯酚/氯仿的有機溶劑除去步驟(2)中朊的上清液至所述核酸純化柱中，用THE洗液清洗，靜止放置，確保所述核酸純化柱中膜徹底干燥，加入滅菌超純水，混勻后洗提DNA。