[發(fā)明專利]一種高通量大規(guī)模篩選組蛋白修飾結(jié)合蛋白質(zhì)的方法

在審

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• 申請日: 2017-02-28
• 公開（公告）號: CN106872714A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜海寧;李鋒;王洪巖;鄭亮德;舒文杰;洪斌;李俊峰
• 申請（專利權(quán)）人: 阿卡斯特（武漢）生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/02
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于表觀遺傳生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量大規(guī)模篩選組蛋白修飾結(jié)合蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

表觀遺傳是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要手段之一。組蛋白是染色質(zhì)的主要成份之一，其氨基端的氨基酸殘基可以被共價修飾，如甲基化、乙?；?、泛素化和磷酸化修飾，這些修飾可以直接改變組蛋白與組蛋白及組蛋白與DNA的相互作用，或者通過招募一些具有特定功能的蛋白或蛋白復(fù)合物調(diào)控基因表達(dá)。組蛋白修飾除了簡單地調(diào)控基因表達(dá)，更在于它可以招募蛋白復(fù)合體，影響下游蛋白，從而參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡和記憶形成，甚至影響免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)等。同時，研究表明，組蛋白修飾與CTD密碼、生物節(jié)律、DNA修復(fù)之間也存在一定的聯(lián)系。

組蛋白修飾調(diào)控基因表達(dá)的一個重要手段是招募其它蛋白或蛋白復(fù)合物來啟運(yùn)下游的生物學(xué)過程。這些蛋白或蛋白復(fù)合物與組蛋白修飾位點之間的相互作用通常是通過一些特定的結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)的。這些結(jié)構(gòu)域通常具有很高的保守性，而且同一類結(jié)構(gòu)域能識別不同的組蛋白修飾位點或同一位點的不同修飾狀態(tài)；另一方面，同一個組蛋白修飾位點又能夠被多個不同結(jié)構(gòu)域所識別(Taverna,S.D.,Li,H.,Ruthenburg,A.J.,etal(2007)Howchromatin-bindingmodules interpret histone modifications:lessons from professional pocket pickers,Nat Struct Mol Biol14,1025-1040)。同一個甲基化位點被不同結(jié)構(gòu)域識別或者同一個結(jié)構(gòu)域識別不同甲基化位點可能啟動不同的下游生物學(xué)過程。

研究蛋白質(zhì)相互作用的方法很多，目前較普遍的生物學(xué)方法包括：免疫共沉淀、GST-pull down、FarWestern分析、噬菌體展示和酵母雙雜交等(Fields S,SongO.Anovel genetic ayaterm to detect protein-protein interactions.Nature,1989,340(6230；245-246)。這些技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)相互作用的研究提供了非常有效的手段。然而，免疫共沉淀、GST-pulldown、FarWestern分析都是針對某一種蛋白質(zhì)相互作用的分析和鑒定，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高通量的要求；噬菌體展示和雙酵母雙雜交技術(shù)雖然可以對蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行大規(guī)模的篩選，但噬菌體展示技術(shù)更適合篩選較短的肽段，而較大蛋白質(zhì)分子由于很難得到噬菌體展示庫，因此對于篩選與其相互作用的蛋白質(zhì)有很大局限性；酵母雙雜交是檢驗在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的一種方法，它的局限性在于所研究的蛋白質(zhì)必須能夠進(jìn)入細(xì)胞核同時該蛋白質(zhì)不是細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

高通量技術(shù)具有高效的特點，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其可實現(xiàn)大規(guī)模高通量的篩選與組蛋白修飾相結(jié)合的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷而提供一種高通量大規(guī)模篩選組蛋白修飾結(jié)合蛋白質(zhì)的方法。具體方法包括(1)將組蛋白修飾多肽固定在載體上，制備組蛋白修飾芯片；(2)待篩選蛋白質(zhì)混合物與組蛋白修飾芯片上固定的多肽發(fā)生反應(yīng)；(3)通過提取已知組蛋白修飾與待篩選蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物，再用LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用的方式鑒定能與已知組蛋白修飾結(jié)合的蛋白質(zhì)種類。

組蛋白修飾芯片上固定有包含溶膠-凝膠材料與組蛋白質(zhì)修飾多肽混合物的位點，且位點均可固定在任意大小的孔板、尼龍膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、玻璃板或硅板上。溶膠-凝膠材料物質(zhì)包含13.5～21重量份的TMOS、8～17重量份的MTMS和3～13.5重量份的GPTMOS。

本發(fā)明所選的固定在載體上的組蛋白修飾多肽底物通常包含6-14個氨基酸，組蛋白修飾多肽底物包括H1、H2A、H2B、H3、H4組蛋白在相關(guān)酶作用下的各個反應(yīng)位點發(fā)生的甲基化、乙?；?、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修飾。

在此檢測已知組蛋白修飾與待篩選蛋白質(zhì)是否結(jié)合，可以通過將待篩選蛋白質(zhì)混合物與組蛋白修飾芯片位點發(fā)生反應(yīng)，然后提取反應(yīng)后的復(fù)合物，再用LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用的方式分析測定碎片離子的大小，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得肽段序列，從而確定和特定的組蛋白修飾結(jié)合的蛋白質(zhì)的種類。

本發(fā)明中，組蛋白質(zhì)修飾芯片載體可以是任意大小的孔板、尼龍膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、玻璃板或硅板，其大小主要是依據(jù)待篩選的蛋白質(zhì)種類數(shù)量而定。

本發(fā)明中，待篩選蛋白質(zhì)優(yōu)選地選自內(nèi)源性蛋白質(zhì)混合物。