[發明專利]一種構建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法及其應用

有效

• 申請號: 201710109602.4
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106857259B
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 包滿珠;暴志茹;張佳琪;劉國鋒;張艷萍;邵長生;王小林
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;A01H4/00
• 代理公司: 42001 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 張紅兵

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種構建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法及其應用。本發明以二球懸鈴木種子萌發的子葉為外植體，通過器官直接再生途徑建立二球懸鈴木子葉不定芽的高頻再生體系。該體系包括五個培養階段：種子消毒；種子萌發；子葉不定芽再生誘導培養；不定芽芽增殖培養與生根培養。通過綜合比較不同激素種類及濃度組合對子葉不定芽的誘導率、平均芽數、生長狀態的影響，優選得到二球懸鈴木子葉不定芽高效再生系列培養基。本發明的方法及其專用培養基可獲得穩定的高頻的二球懸鈴木再生體系。

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種構建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法及其應用。

背景技術

二球懸鈴木(Platanus acerifolia Wind.)是懸鈴木科(Platanaceae)懸鈴木屬(Platanus)落葉大喬木樹種，為一球懸鈴木和三球懸鈴木的雜種(P.occidentalis×P.orientalis)，喜溫暖濕潤氣候，現已于世界各地廣為栽植。二球懸鈴木雜種優勢明顯，冠大蔭濃、樹形優美、樹干斑駁有致，速生、易繁殖、耐修剪、抗逆性強，具有較強的空氣凈化和滯塵減噪能力，享有“行道樹之王”的美譽。我國從二十世紀初開始引入栽培，現于南北各地均有栽培，生長良好。

二球懸鈴木雄花于4-5月份發育成熟，散落大量花粉，同時老球果開始脫落，果毛漫天飛揚，而花粉、果毛又是常見過敏源之一，給市民帶來嚴重的造成呼吸道、皮膚過敏現象。本課題組希望開展基礎生物學研究，利用基因工程育種手段選育出無花無球的二球懸鈴木新品種。

目前關于二球懸鈴木的組織培養已有報道，采用的外植體包括葉片再生、下胚軸再生等為材料，但以二球懸鈴木子葉為外植體進行再生培養成株的研究至今未見報道。而且以懸鈴木葉片、下胚軸作為外植體進行再生培養時，其外植體易褐化死亡，再生芽誘導率低且不穩定，因此建立穩定的高頻的二球懸鈴木再生體系，可為其基因工程育種研究提供試驗依據，有效地推進二球懸鈴木新品種選育進程。

發明內容

本發明的目的在于提供一種二球懸鈴木子葉高頻再生體系的建立方法，本方法以二球懸鈴木成熟種子的子葉為外植體，建立其再生體系，該方法不定芽芽誘導率能達到67％以上，且每片子葉誘導出的不定芽成苗數能達到6-8個，繼代生長良好，可成為遺傳轉化的良好外植體。

本發明的技術方案如下所述：

一種構建二球懸鈴木子葉高頻再生體系的方法，包括以下步驟：

(1)球果的采集

在懸鈴木球果成熟期的10-12月份，從成年的二球懸鈴木樹上采集飽滿的當年生球果；

(2)種子消毒

取球果剝離出種子，先用清水揉搓脫去種毛；將搓洗干凈的種子放于超凈工作臺上按以下程序進行消毒處理：先用75％的酒精消毒40s，再用0.1％的升汞溶液消毒40min，期間晃動種子2-3次，最后用無菌水沖洗3次；

(3)子葉不定芽的再生誘導

將消毒后的種子，放于無菌的培養皿中，培養皿內鋪無菌的濕潤濾紙，在光下萌發培養1周，待子葉展開后，取靠近芽點的中下部子葉接種于子葉不定芽再生誘導培養基中，于光下培養45d至切口處誘導出不定芽，期間每2周更換一次新鮮的子葉不定芽再生誘導培養基；培養溫度為25℃±2℃，光照強度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗；

(4)子葉不定芽的增殖和生根培養

待步驟(3)中子葉再生出的不定芽長至2-3cm時切下，轉移至子葉不定芽增殖培養基中于光下培養40-45d，取頂端3-4cm的頂芽轉入到子葉不定芽生根培養基中進行生根培養；培養溫度為25℃±2℃，光照強度為2400lx，光周期為16h光照/8h黑暗；

上述再生體系中：