[發明專利]一種檢測扎伊爾型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請號: 201710107605.4
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106755600A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 萬成松;李以圣;張寶;趙衛;張其威
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所(普通合伙)44244
• 代理人: 胡濟元,張祖華

1.一種檢測扎伊爾型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括引物、TaqMan熒光探針和陽性標準品，其特征在于：

(1)所述的引物為擴增扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白的編碼基因的高度保守片段的一對引物，其中，

上游引物序列為：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQ NO.1)，

下游引物序列為：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQ NO.2)；

(2)所述的TaqMan熒光探針序列為：

5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’(SEQ NO.3)；

(3)所述的陽性標準品為含有以下序列DNA片段的重組質粒：

TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQ NO.4)。

2.根據權利要求1所述的一種檢測扎伊爾型埃博拉病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的陽性標準品由以下方法制得：

1)根據網絡數據庫GenBank上公布的扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白的編碼基因序列，利用Clustal_X軟件進行序列同源性分析，然后以blastn網絡工具比對分析其特異性，尋找所述編碼基因中高度保守區域的氨基酸序列，再按常規方法合成出所述氨基酸序列的DNA片段；

2)將步驟(1)合成的DNA片段插入質粒載體pUC57(Amp⁺)中構建成重組質粒；

3)取5μl步驟(1)所得到的重組質粒與100μl DH5α感受態細胞混合后，冰浴20分鐘；42℃水浴槽中熱沖擊70～90秒后，迅速冰浴5分鐘；加入500μl LB肉湯培養基，混勻，37℃200rpm搖床培養1小時，得菌液；取100μl菌液在含濃度為100μg/μl的氨芐西林、濃度為20μg/μl的X-gal和濃度為200μg/μl的IPTG的LB培養基平板上進行涂布，培養18小時；然后通過藍白斑篩選，挑取培養基上的白色菌株進行擴大培養；

4)取擴大培養后的白色菌株，按Omega公司提供的質粒快速提取試劑盒的要求進行提取，然后用去離子水稀釋至10⁶copies/μl，即得陽性標準品。