[發明專利]一種檢測鮭魚甲病毒的EvaGreen熒光定量PCR檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201710093115.3
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106755595A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 劉敏;李一經;施文;唐立杰;徐義剛;宋傲臣
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

技術領域

本發明涉及用于病毒檢測的引物和試劑盒，特別是涉及用于檢測鮭魚甲病毒的特異性的熒光定量PCR引物，本發明還涉及利用該引物和Eva Green熒光染料進行鮭魚甲病毒檢測的方法和試劑盒。本發明屬于病毒檢測技術領域。

背景技術

鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)隸屬于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒屬(Alphavirus)，主要感染大西洋鮭(salmo salar)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和褐鱒(Salmo trutta L.)等鮭科魚類引起胰臟病、心肌炎癥和昏睡等癥狀，致死率達1％～48％，并在水產養殖的各個階段均有爆發。1995年Nelson等在愛爾蘭首次從患胰臟病的大西洋鮭和虹鱒體內分離出該病毒，1997年Castric等又在法國從患昏睡病的大西洋鮭和虹鱒體內分離到SAV，目前該病廣泛流行于英格蘭、蘇格蘭、挪威、法國、波蘭、意大利和西班牙等歐洲國家，據統計從1995年至2007年發病率逐年增加高達90％，每年由此疫病造成巨大的經濟損失。2013年鮭魚甲病毒感染被列入OIE水生動物疫病名錄中。雖然，我國目前尚未有文獻報道檢測到該病毒，但是，隨著近年我國對鮭科魚類進口和鮭科魚類卵引進的增加，該病傳入我國的風險也日益增大。因此，我國建立SAV快速診斷和測檢方法是緊迫的任務。

目前已發現六個基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5、SAV 6)。其中，SAV 1、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6可感染大西洋鮭引起胰腺病(Salmon pancreas disease，PD)；SAV 2可感染虹鱒引起睡病(Sleeping disease，SD)。SAV病毒粒子具有囊膜，大小為65nm。單股正鏈RNA病毒，基因組長11-12kb，且含有兩個開放閱讀框(ORF)。基因組的第二個ORF編碼26S子基因的mRNA，最終產生5個結構蛋白，即衣殼蛋白、E3、E2、6K、和E1共同構成了病毒的囊膜糖蛋白。E2在未成熟時，與E3相連，組成E2的前體，E3的作用相當于E2的信號肽。當E2成熟時，E2與E3分離，E2被轉運到病毒粒子表面。

近年來，我國一些地方，特別是北方地區，大規模發展了冷水魚類(如：虹鱒)養殖，且取得了巨大的經濟效益。雖然我國目前尚未發現該病毒，但是隨著近年我國對鮭科魚類進口的增加，該病傳入我國的風險也日益增大，因此有必要盡早建立對鮭魚甲病毒快速靈敏的檢測方法，防止該病傳入我國，SAV的有效預報或者診斷是我們必須解決的問題。

核酸檢測技術因具有快速、靈敏、特異性強等特點，已成為鮭魚甲病毒的主要檢測技術，廣泛用于臨床樣品的檢測和分子流行病學調查。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠簡便、快速、靈敏、特異和高效地檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供檢測鮭魚甲病毒的熒光定量PCR方法。該方法檢測覆蓋鮭魚甲病毒六個基因型，是一種特異性強，準確性高、靈敏性高的檢測方法。

為了實現本發明目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明對已知鮭魚甲病毒基因序列進行比對，篩選出鮭魚甲病毒六個基因型的保守區序列，即E2蛋白基因中的一段保守序列(9471-9668bp)。針對該序列本發明發明人經反復篩選和驗證，得到一對用于檢測鮭魚甲病毒六個不同基因型的熒光定量PCR引物，擴增片段大小為197bp(SEQ ID NO.1所示)，所述引物的序列如下：

上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQ ID NO.3)

進一步的，本發明還提出了一種用于檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，含有用于檢測鮭魚甲病毒的熒光定量PCR引物對以及Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液，其中所述的引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發明所述的試劑盒中，優選的，所述Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液包括dNTPs、Mg²⁺、Eva Green、DNA聚合酶和RNA酶抑制劑。

在本發明所述的試劑盒中，優選的，所述Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液為Golden HS EVA Green qPCR Mix。