[發(fā)明專利]一種檢測鮭魚甲病毒的EvaGreen熒光定量PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710093115.3
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106755595A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉敏;李一經(jīng);施文;唐立杰;徐義剛;宋傲臣
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,馬鑫

1.一種用于檢測鮭魚甲病毒的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，含有用于檢測鮭魚甲病毒的熒光定量PCR引物對以及Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液，其中所述的引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液包括dNTPs、Mg²⁺、Eva Green、DNA聚合酶和RNA酶抑制劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述Eva Green熒光定量PCR擴增緩沖液為Golden HS EVA Green qPCR Mix。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照，所述的陽性對照為含有鮭魚甲病毒E2基因的重組質(zhì)粒標(biāo)準品，所述的陰性對照為去離子水。

5.如權(quán)利要求1-4任一項所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，用于檢測鮭魚甲病毒時，包括以下步驟：

(1)將待測樣本勻漿，離心，取上清進行總RNA提取；

(2)以步驟(1)得到的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，總cDNA樣品保存至-80℃，備用；

(3)以步驟(2)得到的總cDNA、陽性對照品和陰性對照品分別為模板，在熒光定量PCR儀上進行PCR擴增；

(4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，記錄樣品的Ct值和起始DNA拷貝數(shù)。

6.如權(quán)利要求5所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，PCR擴增反應(yīng)體系為：5×Golden HS EVA Green qPCR Mix 4μl，50×ROX Reference Dye0.4μl，濃度為0.3μM的上游引物及下游引物各0.5μl，模板1μl，最后用滅菌的去離子水補至20μl。

7.如權(quán)利要求6所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為：(1)95℃預(yù)變性15min；(2)95℃變性10s、60℃退火30s，共40個循環(huán)。

8.如權(quán)利要求5所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準如下：Ct值≤40.0時樣品結(jié)果為陽性；Ct值＞40.0的樣品結(jié)果為陰性。

9.權(quán)利要求2-8任一項所述的Eva Green熒光定量PCR試劑盒在制備檢測鮭魚甲病毒的試劑中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的鮭魚甲病毒包括以下六個基因型：SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5以及SAV 6。