[發(fā)明專利]一種檢測小分子物質(zhì)的銀納米粒子消光免疫層析試紙條

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710091845.X
• 申請日: 2017-02-21
• 公開（公告）號: CN106841637B
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊勇華;江湖;郭亮;李響敏;賴衛(wèi)華;聶麗娟
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測小分子物質(zhì)的銀納米粒子消光免疫層析試紙條，其特征是制備方法為：

（1）熒光物質(zhì)與牛血清白蛋白簡稱BSA通過羧基和氨基間共價鍵結(jié)合：

所選用的熒光物質(zhì)為熒光微球、量子點(diǎn)微球、量子點(diǎn)或熒光染料；熒光物質(zhì)需先經(jīng)過表面氨基或羧基修飾，再與BSA上的羧基或氨基通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽簡稱EDC活化共價結(jié)合，得熒光物質(zhì)-BSA；熒光物質(zhì)的最適激發(fā)波長和最大發(fā)射波長二者至少其一在400 nm至500 nm之間；

（2）制備銀消光探針：

1）采用種子逐步生長法合成銀納米粒子，對每一步的銀粒子測定紫外吸收峰，當(dāng)峰值達(dá)到與所選用的配對熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長或發(fā)射波長一致時停止生長；具體方案為a）銀種子制備：在100 mL體系中調(diào)整檸檬酸鈉簡稱SC濃度至5 mM，單寧酸簡稱TA 0.1 mM，加熱劇烈攪拌，一開始沸騰，立即加入1 mL 25 mM AgNO₃，溶液馬上變成亮黃色，補(bǔ)足體系體積至100 mL，得到種子銀大小約15 nm的種子銀溶液；b）銀粒子逐步生長：在100 mL體系中移除19.5 mL反應(yīng)液，加入16.5 mL水，溫度設(shè)定到90℃，加入0.5 mL 25 mM SC，1.5 mL 2.5mM TA，1 mL 25 mM AgNO₃，補(bǔ)足體系體積至100 mL，攪拌30 min。重復(fù)“移除19.5 mL反應(yīng)液，加入16.5 mL水，0.5 mL 25 mM SC，1.5 mL 2.5 mM TA和1 mL 25 mM AgNO₃，補(bǔ)足體系體積至100 mL，90℃攪拌30 min”這一過程，紫外掃描監(jiān)測銀納米粒子 SPR吸收峰的變化情況，直到獲得SPR吸收峰與配對熒光材料的最大激發(fā)波長或發(fā)射波長相同，得銀納米粒子；

2）銀納米粒子與待檢小分子單克隆抗體結(jié)合：取1mL 銀納米粒子溶液，粒子數(shù)為10¹⁰至10¹²，5000轉(zhuǎn)至10000轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清；沉淀重懸于1 mL含待檢小分子抗體的0.1 M硼酸溶液，其中IgG含量1 μg至80 μg，用NaOH調(diào)整pH到7.0至7.5；20℃磁力攪拌器上攪動2 h，5000轉(zhuǎn)至10000轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清；沉淀重懸于pH 7.0至7.5 含0.1%（w/v）BSA的0.1M硼酸溶液中，5 min后，5000轉(zhuǎn)至10000轉(zhuǎn)離心10 min，沉淀重懸于0.25 mL pH 7.0至7.5 含0.1%（w/v）BSA的0.1M硼酸溶液中，得銀消光探針，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）檢測抗原制備：

將小分子待測物與BSA通過共價鍵結(jié)合；先活化小分子待測物上非抗體識別位點(diǎn)的基團(tuán)，然后與BSA分子上氨基或羧基通過共價鍵結(jié)合得小分子待測物-BSA；該方法與制備小分子人工抗原的方法相同；

（4）銀納米粒子消光免疫層析試紙條的組裝：

試紙條包括濾紙、樣本墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜簡稱NC膜和吸水紙五部分組成；其中濾紙、樣本墊與結(jié)合墊層疊組裝在NC膜一端，吸水紙層疊在NC膜另一端，五部分整體固定在粘性卡紙上；其中結(jié)合墊上承載銀消光探針，每個試紙條結(jié)合墊固定探針數(shù)量為10⁶至10⁸個；檢測線上固定待檢小分子的檢測抗原和熒光物質(zhì)-BSA，每個試紙條檢測線上固定小分子檢測抗原0.1 μg至0.5 μg；質(zhì)控線上固定抗IgG抗體即二抗和熒光物質(zhì)-BSA，每個試紙條質(zhì)控線上固定抗IgG抗體10 ng至100 ng；檢測線和質(zhì)控線上固定熒光物質(zhì)-BSA的量均以熒光物質(zhì)質(zhì)量計(jì)算為1 ng至50 ng；距離檢測線4.0 mm 至6.0 mm處噴涂質(zhì)控線；切割成寬度3.8 mm每條，裝入試紙條卡盒中，卡盒與常規(guī)的膠體金速測卡盒相同，內(nèi)有試紙條固定卡槽，在試紙條的濾紙位置留有加樣孔，在NC膜上檢測線和質(zhì)控線位置留有檢測窗口；試紙條檢測卡與干燥劑一起裝入避光袋密封保存待用。