[發明專利]一種用于豬孤雌激活胚的體外培養液及培養方法

有效

• 申請號: 201710090092.0
• 申請日: 2017-02-20
• 公開（公告）號: CN106834216B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 張德福;戴建軍;張樹山;吳彩鳳;陳亞寧;王文杰
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京市領專知識產權代理有限公司 11590
• 代理人: 林輝輪

本發明公開了一種用于豬孤雌激活胚的體外培養液(mPZM?3)及培養方法，屬于動物胚胎體外培養領域，所述體外培養液(mPZM?3)的原料包括mPZM?3基礎培養液及五水乳酸鈣和丙酮酸鈉，且所述體外培養液中五水乳酸鈣的濃度為0.606g/L，丙酮酸鈉的濃度為0.022g/L；所述體外培養液所用溶劑為富氫水，且其中H₂的含量為1.2～1.6ppm；所述體外培養液用于豬孤雌激活胚的培養方法為：先將豬孤雌激活胚胎用含5μmol/L細胞松弛素B的體外培養液洗滌并在其中處理3～5h，再用未添加細胞松弛素B的體外培養液洗滌并在其中培養168h，至胚胎發育成囊胚。本發明能保證較好地為豬孤雌激活胚胎提供能量和發育環境，從而提高其胚胎培養質量和效果。

技術領域

本發明涉及動物胚胎體外培養領域，具體的涉及一種用于豬孤雌激活胚的體外培養液及培養方法。

背景技術

動物胚胎的體外培養是胚胎生物技術中的重要環節。在體外培養條件下，早期胚胎往往不能完成從受精卵到囊胚的發育全過程，而停頓在某個特定發育時期，這一現象被稱為胚胎體外發育阻斷(in vitro block of embryonic development)，因而嚴重影響早期胚胎體外發育質量，如豬體外囊胚發育率一般僅為20％左右，內細胞團數量在30個左右，導致后代的出生率下降，極大地阻礙了豬在農業、生物工程和醫學中的研究應用。

動物胚胎的體外培養與三方面的因素有關，即胚胎種類、培養條件和培養液的成分，其中培養液成分的改進是體外培養技術的基礎和關鍵環節所在，直接影響到體外培養效果和體外生產胚胎的質量。

孤雌激活胚胎是將卵母細胞激活后，使其能完成成熟分裂，并由此向有絲分裂過渡，開始新的個體發生。對哺乳動物孤雌激活的研究，將加深對胚胎發生、核移植等許多重大理論問題的認識。孤雌激活的成功，對野生動物保護、轉基因動物制作以及生物發育機制的深入研究等也具有重要的理論和現實意義。

目前，現有的用于豬孤雌激活胚的體外培養液及培養方法不能保證卵母細胞的激活穩定，不能較好地為細胞代謝提供所需能量，且不足以獲得較高的胚胎培養質量和效果。

發明內容

1.要解決的技術問題

本發明要解決的技術問題在于提供一種促進胚胎體外發育的用于豬孤雌激活胚的體外培養液及培養方法。

2.技術方案

為解決上述問題，本發明采取如下技術方案：

一種用于培養豬孤雌激活胚胎的體外培養液，所述體外培養液的原料包括mPZM-3胚胎培養液及五水乳酸鈣和丙酮酸鈉，且所述體外培養液中五水乳酸鈣的濃度為0.606g/L，丙酮酸鈉的濃度為0.022g/L；所述體外培養液所用溶劑為富氫水，且其中H₂的含量為1.2～1.6ppm。

進一步地，所述mPZM-3胚胎培養液的原料包括mPZM-3基礎培養液、L-谷氨酰胺、亞牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸鏈霉素以及牛血清白蛋白，且它們的配比為1L：0.146g：0.546g：0.069g：100000IU：70000IU：3g。

更進一步地，所述mPZM-3基礎培養液包括如下濃度的溶質：氯化鈉6.312g/L，碳酸氫鈉2.119g/L，氯化鉀0.746g/L，磷酸二氫鉀0.048g/L，硫酸鎂0.048g/L；還包括2％的必需氨基酸和1％的非必需氨基酸。

對于豬孤雌激活胚胎，所述體外培養液中富氫水的H₂濃度以1.4ppm效果較好。

本發明還提供了上述體外培養液用于培養豬孤雌激活胚胎的方法，包括如下步驟：

(1)將豬孤雌激活胚胎在含5μmol/L細胞松弛素B的體外培養液中洗三次，移入含5μmol/L細胞松弛素B的體外培養液中培養3～5h；