[發(fā)明專利]一種條件性過表達AQP4轉(zhuǎn)基因小鼠的模型制作方法

在審

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• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106893740A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖明;王臨梅;馮維熙
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 南京睿之博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司32296
• 代理人: 陳琛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立一種腦內(nèi)條件性過表達水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)蛋白生物模型的方法。

背景技術(shù)

模型小鼠是研究疾病發(fā)病機制、治療策略必不可少的工具，目前建立模型小鼠的主要方法是轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組參與跨膜水轉(zhuǎn)運的四聚體結(jié)構(gòu)膜通道蛋白家族，目前已經(jīng)從哺乳動物組織中分離得到了13種AQPs(AQP0--AQPl2)。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運功能的不同，將其分成3類：水特異性通道蛋白、水甘油通道蛋白以及超水通道蛋白。

AQP4屬于水特異性通道蛋白。aqp4基因定位于18q11.2和q12.I之間，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，外顯子分別編碼127，55，27，92位氨基酸序列。AQP4蛋白由4個相對分子質(zhì)量約30 000的單體組成，每個單體具有各自獨立的水通透性，其單體結(jié)構(gòu)包括6個跨膜區(qū)域和5個環(huán)(A、B、C、D、E環(huán))。其中B、D環(huán)及羧基、氨基末端均在胞內(nèi)，A、C、E環(huán)位于胞外。整個分子呈對稱鏡像結(jié)構(gòu)，且B、E環(huán)顯著疏水，參與調(diào)解水通道活性。在B、E環(huán)上各自擁有一個由天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸組成的序列，該序列為AQPs家族成員共有的特征性結(jié)構(gòu)。

AQP4是分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道蛋白，特異性分布于星形膠質(zhì)細胞足突和室管膜，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運，是腦脊液的生成吸收、滲透壓的調(diào)節(jié)、腦水腫的形成及清除等病理生理過程的分子基礎(chǔ)。近來研究表明，AQP4調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的系列生理功能，如介導(dǎo)水快速轉(zhuǎn)運、維持細胞外液離子平衡、影響神元活動和突觸重塑、參與成年的神經(jīng)發(fā)生等。此外AQP4還可能參與了腦中風(fēng)、視神經(jīng)脊髓炎、阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進程。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于提供一種條件性過表達AQP4轉(zhuǎn)基因小鼠的模型制作方法，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立AQP4條件性過表達小鼠模型，以獲得一種可穩(wěn)定遺傳、對其中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)AQP4蛋白表達時間可控的小鼠模型。該模型將可用于研究該蛋白在體功能分析、疾病發(fā)病機制探討、藥物新靶點發(fā)現(xiàn)及臨床前藥效評價等研究，具有十分重要的科學(xué)意義和臨床價值。

技術(shù)方案：本發(fā)明的一種條件性過表達AQP4轉(zhuǎn)基因小鼠的模型制作方法，包括以下步驟：

第1步：hGFAP-mAQP4(hGFAP代表人源性的膠質(zhì)纖維酸性蛋白基因啟動子，mAQP4代表鼠源性的水通道蛋白4基因)轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建；

第2步：轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射；

第3步：品系基因鑒定，最終建立小鼠基因組中帶有外源AQP4基因的遺傳性小鼠突變模型。

第1步中所述的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建方法是:合成5'UTR-Aqp4CDS-3'untranslated and polyA sequence(5’非編碼區(qū)-Aqp4基因編碼區(qū)-3’非編碼區(qū)以及多聚腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)尾序列)，連接到pTRE3G(四環(huán)素依賴誘導(dǎo)表達載體)，然后將以上序列片段酶切下來連接到pInsulator(絕緣子載體)，合成人源GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)啟動子序列，與CMV(增強子)融合后連接到rtTA3G-polyA(四環(huán)素依賴誘導(dǎo)表達載體-多聚腺嘌呤核糖核苷酸結(jié)尾序列表達載體)上，再將片段酶切下來，連接到上一步構(gòu)建好的載體中，完成整個載體的構(gòu)建。

第2步所述的轉(zhuǎn)基因載體原核顯微注射是：將外源線性轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6(品系名稱)小鼠受精卵細胞核內(nèi)；外源性基因會隨機插入到小鼠基因組中，最終構(gòu)建的hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因小鼠能夠在攝入強力霉素后過表達AQP4(水通道蛋白4)蛋白，便于進行后續(xù)的蛋白印跡實驗。

第3步所述的基因鑒定是：出生的首代hGFAP-mAQP4轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠即為首建鼠；每只首建鼠都將被視為一個獨立的品系進行繁育，對每只首建鼠品系都進行剪尾基因鑒定。

有益效果：本發(fā)明提供可條件性誘導(dǎo)過表達AQP4蛋白的模型小鼠，實現(xiàn)了通過人為時間點調(diào)控，對不同月齡小鼠進行條件誘導(dǎo)增加其腦內(nèi)AQP4蛋白表達水平，觀察其小鼠在基礎(chǔ)狀態(tài)以及神經(jīng)精神疾病模型狀態(tài)下星形膠質(zhì)細胞生物學(xué)特性和功能產(chǎn)生何種影響。該模型的建立，有助于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制、藥物新靶點發(fā)現(xiàn)及臨床前藥效評價等。

附圖說明

圖1.轉(zhuǎn)基因小鼠制作流程。