[發明專利]一種大腸桿菌融合表達菌絲霉素、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201710085950.2
• 申請日: 2017-02-17
• 公開（公告）號: CN106967740B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 趙俊;甘霖;王明麗
• 申請（專利權）人: 蕪湖天明生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;A23K20/147;A23L33/195;A23L3/3535;A61K38/16;A61K47/64;A61P31/04
• 代理公司: 合肥天明專利事務所(普通合伙) 34115
• 代理人: 金凱

本發明公開了一種融合表達菌絲霉素、其制備方法和應用，該重組菌絲霉素的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；按照大腸桿菌偏愛密碼子設計的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發明利用原核表達載體構建了能夠表達菌絲霉素?硫氧還蛋白融合蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。將該菌株擴增培養，通過異丙基?β?D?硫代半乳糖苷誘導表達，離心收獲菌體，裂解菌體后離心收獲上清，經過親和層析純化獲得菌絲霉素融合蛋白，無需通過酶切去除硫氧還蛋白即可以顯著抑制革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等的生長。本發明無需通過酶切去除融合蛋白即可有顯著的抑菌作用，大大降低了生產成本。

背景技術

抗菌肽是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質，它是機體先天性免疫系統的重要組成部分。由于抗菌肽對細菌、真菌、寄生蟲、病毒、腫瘤細胞等有著廣泛的抑制作用，并且隨著越來越多的抗生素耐藥微生物的出現，使得抗菌肽在醫藥行業和食品添加劑等領域有良好的應用前景。菌絲霉素是一種真菌防御素，屬于抗菌肽的一種。菌絲霉素的成熟功能片段有40個氨基酸,其分子量為4.4kD,其生物學活性主要表現為對革蘭氏陽性菌有較強的殺菌作用,尤其是對肺炎鏈球菌、膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等,有與青霉素、萬古霉素相當的抗菌作用。研究表明菌絲霉素在體外抑菌試驗、動物試驗及一些臨床試驗中表現出無細胞毒性優勢,且不產生耐藥性,因此作為抗生素替代物具有相當大的治療潛力。

目前國內外對菌絲霉素基因工程表達已有了一些研究，但是由于菌絲霉素抗菌肽具有抗菌作用，表達宿主如大腸桿菌中表達的菌絲霉素抗菌肽會反饋性抑制宿主細胞活性，影響菌絲霉素抗菌肽的進一步表達，因此在菌絲霉素抗菌肽基因工程研究中常采用酵母菌表達，或者大腸桿菌中加上大的融合蛋白一起表達后采用酶切去除融合蛋白標簽純化后制得，但兩種不同的表達方式成本均較高，不適合廣泛用于動物飼料添加劑、抗菌藥物制劑、保健品或防腐劑，因此市場上尚無成熟的菌絲霉素抗菌肽產品。而本發明采用大腸桿菌融合表達的菌絲霉素無需酶切去除融合蛋白標簽，對革蘭氏陽性菌有較強的殺菌作用，但對宿主大腸桿菌無明顯毒性，解決了菌絲霉素產業化的瓶頸問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種融合表達菌絲霉素的制備及應用方法，該方法利用大腸桿菌表達系統表達菌絲霉素融合蛋白，所制備的菌絲霉素抗菌肽可應用于治療、預防革蘭氏陽性菌感染或作為畜禽飼料添加劑。

本發明首先提供一種菌絲霉素融合蛋白，由菌絲霉素抗菌肽和硫氧還蛋白融合表達獲得，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

上述菌絲霉素融合蛋白的一種基因編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

上述菌絲霉素融合蛋白的表達和純化的方法，包括以下步驟：

1)根據菌絲霉素和硫氧還蛋白氨基酸序列按照大腸桿菌密碼子偏好設計融合基因DNA序列；

2)人工合成步驟1)中融合基因，連接入原核表達載體中，構建成表達重組質粒；

3)將構建的表達重組質粒轉化宿主菌，構建能表達菌絲霉素融合蛋白的重組基因工程菌；

4)對該重組基因工程菌進行增值培養和誘導表達培養，收集菌體；

5)將步驟4)所得菌體，進行裂解，離心，收集裂解上清；

6)對步驟5)中所得菌體裂解上清進行Ni-NTA親和層析純化，即得菌絲霉素融合蛋白。

本發明的有益效果是：

本發明利用大腸桿菌原核表達系統制備了一種新的菌絲霉素融合蛋白，將菌絲霉素抗菌肽與硫氧還蛋白融合表達，有利于抗菌肽中巰基的形成，實現可溶性表達，同時也有利于菌絲霉素發揮抑菌作用，不必通過蛋白酶切除硫氧還蛋白也可以發揮菌絲霉素抑菌作用，大大降低了制備成本，解決了產業化的瓶頸問題。

附圖說明

圖1為菌絲霉素融合蛋白的模擬空間構象圖；