[發(fā)明專利]一種腸γδT細(xì)胞的分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710084479.5
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106754707A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊輝
• 申請（專利權(quán)）人: 南京市兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞分離方法，具體為一種腸γδT細(xì)胞的分離方法

背景技術(shù)

γδT細(xì)胞，又被稱為I型T細(xì)胞，是一類表型和功能獨(dú)特的T細(xì)胞亞型，它與αβT細(xì)胞共同組成CD3⁺T細(xì)胞。γδT細(xì)胞具有抗感染、抗腫瘤的重要作用，它還參與了微生物感染的免疫防御，此外，γδT細(xì)胞對維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用。但是，長期以來，由于γδT細(xì)胞在外周血中分布極少，僅占T細(xì)胞總數(shù)的0.5％-5％，分離比較困難；而γδT細(xì)胞在腸黏膜分布廣泛。

目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道采用處死動物后，快速取出小腸(包括空腸和回腸)組織，機(jī)械振蕩及化學(xué)作用離散腸組織，銅網(wǎng)過濾，用40％-70％不連續(xù)Percoll梯度單次離心及先用30％Percoll離心再用40％-70％Percoll二步法離心，吸取和移出白色細(xì)胞層，分離總淋巴細(xì)胞。然后加入免疫熒光標(biāo)記TCRγδ抗體標(biāo)記，磁式細(xì)胞儀分選γδT細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測γδT細(xì)胞純度。但該方法步驟較多，機(jī)械振蕩及化學(xué)作用對細(xì)胞損傷大，分離總細(xì)胞數(shù)量少，γδT細(xì)胞活性低和純度低，應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的腸γδT細(xì)胞的分離方法需要經(jīng)過機(jī)械振蕩及化學(xué)作用對細(xì)胞損傷大，分離總細(xì)胞數(shù)量少的缺陷，提供一種腸γδT細(xì)胞的分離方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種腸γδT細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟：

1)、收集動物的腸淋巴細(xì)胞，離心，去掉上清液，生理鹽水懸浮腸淋巴細(xì)胞；

2)、用熒光標(biāo)記的抗γδTCR抗體標(biāo)記收集到的腸淋巴細(xì)胞，然后加入抗熒光微珠標(biāo)記的抗FITC單克隆抗體，然后上磁式細(xì)胞分選儀優(yōu)化分選，收集陽性選擇的細(xì)胞，即得到γδT細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟1)中采用腸系膜淋巴管插管法收集動物的腸淋巴細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟2)中采用異硫氰酸熒光素交聯(lián)的抗γδTCR單克隆抗體標(biāo)記收集到的腸淋巴細(xì)胞，每1×10⁸個(gè)腸淋巴細(xì)胞加100μl異硫氰酸熒光素交聯(lián)的抗γδTCR單克隆抗體，4℃孵育30分鐘，用緩沖液洗2次。

進(jìn)一步的，所述步驟2)中每1×10⁸個(gè)腸淋巴細(xì)胞加100μl抗熒光微珠標(biāo)記的抗FITC單克隆抗體，4℃孵育15分鐘，用緩沖液洗1次。

腸γδT細(xì)胞分離的關(guān)鍵是要獲得大量高純度的活性腸淋巴細(xì)胞。腸系膜淋巴管匯集整個(gè)腸道活性淋巴細(xì)胞，純度為100％，不包括其它任何類型的細(xì)胞。因此，通過腸系膜淋巴管插管法收集腸淋巴細(xì)胞能夠保證短時(shí)間內(nèi)獲得大量高純度活性淋巴細(xì)胞，僅需一個(gè)步驟即可分離，從而避免了反復(fù)機(jī)械振蕩及化學(xué)作用使組織勻漿、過濾、離心分離等多個(gè)步驟導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，活性細(xì)胞數(shù)量下降。此外，相比分離整個(gè)腸組織或分離腸組織中的淋巴結(jié)都不可避免地混雜其它類型的細(xì)胞，從而使淋巴細(xì)胞純度下降，最終收獲的細(xì)胞總數(shù)量較低。本方法可以獲得高純度的總數(shù)較多的活性淋巴細(xì)胞，而且費(fèi)時(shí)短。

本發(fā)明通過腸系膜淋巴管插管法直接、高效的收獲腸淋巴細(xì)胞，然后通過磁式細(xì)胞儀進(jìn)一步分離腸γδT細(xì)胞操作簡便，費(fèi)時(shí)短，整個(gè)分離方法簡單、高效，收獲細(xì)胞數(shù)量多，活性高、純度高，有利于發(fā)揮其生物學(xué)功能。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種腸γδT細(xì)胞的分離方法，包括以下步驟：

1)、收集動物的腸淋巴細(xì)胞，離心，去掉上清液，生理鹽水懸浮腸淋巴細(xì)胞；