[發(fā)明專利]一種靶向PD?1的融合蛋白及其相關(guān)應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710084450.7
• 申請日: 2017-02-16
• 公開（公告）號: CN106832002A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧剛;丘桂華;吳國祥;岳喜連
• 申請（專利權(quán)）人: 上海科醫(yī)聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10;A61K38/17;A61K47/68;A61P37/04;A61P35/00
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 俞滌炯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種靶向PD-1的融合蛋白及其相關(guān)應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤可以通過多種抑制免疫系統(tǒng)及其效應(yīng)因子的機制來達到免疫逃逸的目的。基于對腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)原則的不斷深入研究，提高抗腫瘤細胞免疫功能和消除腫瘤細胞對免疫細胞抑制性因素，已發(fā)展成為免疫治療的重要策略。在抗腫瘤免疫反應(yīng)體系中，T細胞作為重要的參與者其反應(yīng)效應(yīng)和反應(yīng)強度受多種共刺激信號和共抑制信號所調(diào)控，而其中介導(dǎo)抑制信號的即被稱為免疫檢查點。

近年來對于免疫檢查點與腫瘤免疫逃逸關(guān)系的研究越來越深入，包括免疫檢查點分子的結(jié)構(gòu)與功能、信號通路、腫瘤表達譜與腫瘤預(yù)后等研究也越來越廣泛，而其中尤其以PD-1/PD-L為代表的臨床腫瘤免疫治療靶點研究更具應(yīng)用前景。

作為負性免疫調(diào)節(jié)因子的PD-1及其配體PD-L分子，其對于腫瘤的治療效果以及腫瘤預(yù)后的重要作用與其受配體相互作用所傳遞的信號通路密切相關(guān)。PD-1是一種細胞膜蛋白受體，調(diào)節(jié)免疫細胞功能的一個關(guān)鍵點，主要表達于激活的T細胞和B細胞以及其他免疫細胞，PD-1在結(jié)構(gòu)上與免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域類似，包括胞外免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)樣結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三個部分，功能是抑制T細胞的過度激活，這是免疫系統(tǒng)的一種正常的自穩(wěn)機制，因為過度激活的T/B細胞會導(dǎo)致自身免疫病。腫瘤微環(huán)境會誘導(dǎo)腫瘤浸潤T細胞高表達PD-1分子，同時腫瘤細胞會通過高表達PD-1的配體PD-L1和PD-L2，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1信號通路持續(xù)激活，從而抑制T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

免疫檢查點存在的作用是一方面參與維持對自身抗原的免疫耐受，避免自身免疫性疾病，另一方面避免免疫反應(yīng)的過度激活對機體組織造成的損傷。更重要的是，以PD-1為代表的免疫檢查點分子作為負性免疫調(diào)節(jié)分子，在介導(dǎo)腫瘤細胞免疫逃逸中同樣發(fā)揮著重要的作用。由于在正常組織中這些檢查點能夠抑制T細胞的過度反應(yīng)，而在腫瘤組織中則能夠被腫瘤利用形成免疫逃逸，即腫瘤可以通過免疫檢查點來抑制T細胞激活，從而逃避免疫殺傷反應(yīng)；反之阻斷這種檢查點所傳到的信號則能解除免疫細胞的抑制狀態(tài)，使其發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。

基于此，通過激活機體免疫反應(yīng)以及解除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)是腫瘤免疫治療中的核心策略，其中針對以PD-1為代表的免疫檢查點分子的阻斷是激發(fā)免疫細胞活化的有效策略之一，也是近些年抗腫瘤藥物開發(fā)最熱門靶點。因此，通過構(gòu)建靶向PD-1的蛋白制劑來有針對性地阻斷PD-1所介導(dǎo)的信號通路進而增強免疫細胞功能不僅是免疫治療的重要策略，也是當(dāng)前腫瘤治療的急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種靶向PD-1的融合蛋白制劑，具體而言，一種能靶向并阻斷PD-1分子從而增強免疫細胞功能的融合蛋白制劑。

本發(fā)明第一方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白制劑，所述融合蛋白分別包含氨基端的人程序性細胞死亡配體2胞外段區(qū)域和羧基端的人免疫球蛋白G亞型1恒定區(qū)片段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明第二方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白的編碼核酸，所述核酸序列如SEQ ID NO:2所示。由于一種氨基酸可以有多種密碼子編碼，因此在某些實施方案中，可以根據(jù)實際需要對上述編碼所述融合蛋白分子的DNA核酸序列的密碼子進行突變，特別是使用真核細胞偏好密碼子，但所編碼融合蛋白的氨基酸序列不變。

本發(fā)明第三方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白的重組載體，所述重組載體包括SEQ ID NO:2所示的編碼核酸；重組載體可選用真核表達載體或者原核表達載體；優(yōu)選為pcDNA3真核表達載體。

本發(fā)明第四方面提供一種細胞株，所述細胞株經(jīng)過基因工程改造，所述細胞株包括上述重組載體并能夠穩(wěn)定高效地分泌表達靶向PD-1的融合蛋白；細胞株可選用多種工程細胞株，優(yōu)選人胚腎細胞(293細胞)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)。

本發(fā)明第五方面提供一種靶向PD-1的融合蛋白的制備方法，具體包括如下步驟：

步驟一，將如SEQ ID NO:2所示的編碼核酸導(dǎo)入表達載體，構(gòu)建重組表達載體；

步驟二，將所述步驟一獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，進一步篩選獲得穩(wěn)定高效分泌表達融合蛋白的細胞株；

步驟三，將所述步驟二獲得的細胞株在合適條件下進行擴增培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清并純化獲得融合蛋白。