[發明專利]一種用于造血干細胞培養的滋養層的制備方法

在審

• 申請號: 201710076709.3
• 申請日: 2017-02-13
• 公開（公告）號: CN106754715A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 羅茂文;陳強;楊本艷姿;段海峰;張博
• 申請（專利權）人: 四川新生命干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0789
• 分類號: C12N5/0789
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

技術領域

本發明涉及一種用于造血干細胞的滋養層的制備方法。

背景技術

臍帶血被認為是一種除了骨髓移植以外治療血液系統疾病，尤其是血液系統腫瘤的重要資源。從1988年第一例臨床成功移植臍帶血以來，其應用隨著細胞治療研究的發展得到的了長足的進步。雖然相比骨髓和外周血，臍帶血在造血重建中的應用比例仍然處于相對較低的水平，到目前為止，超過25000例臍帶血成功移植的案例仍使人們對這一曾被丟棄的寶貴資源充滿了信心。作為造血干細胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)的來源，臍帶血對比骨髓和外周血有兩個天然的優勢，首先，臍帶血移植的移植物抗宿主病(GVHD)風險遠遠小于其他兩者，這對異體移植的成功有重要意義；其次，臍帶血移植時的HLA配型要求很低，大大的降低了患者獲取可用細胞源的難度。盡管如此，臍帶血想要替代骨髓成為HSC最主要的來源并非易事，其中有兩個問題是制約臍帶血造血干細胞的主要原因，即數量不足和植入時間長。為了克服臍帶血的這些不足之處，研究人員嘗試了許多不同的方法，其中分離并體外擴增臍帶血造血干細胞是目前被認為最有臨床前景的手段。

間充質干細胞(MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層，可以以其作為滋養層培養造血干細胞。但是，采用MSC作為滋養層培養造血干細胞時，MSC會大量增殖，并在培養一段時間后會大量脫落凋亡，產生的大量溶酶體等物質，并改變培養基pH值環境，極大的影響造血干細胞的擴增，并引起凋亡。有文獻報道用絲裂霉素處理MSC細胞可以阻止其增殖，但殘留的絲裂霉素會對將要擴增的造血干祖細胞造成非常不利的影響。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種新的用于造血干細胞的滋養層的制備方法。

本發明用于造血干細胞的滋養層的制備方法，步驟如下：

(1)取細胞培養板，包被膠原蛋白，得包被了膠原蛋白的細胞培養板；

(2)取間充質干細胞的細胞懸液，接種到步驟(1)中包被了膠原蛋白的細胞培養板中，培養至細胞融合度為70-90％時，即可。

步驟(1)中，所述膠原蛋白是鼠尾膠原蛋白。

步驟(1)中，每孔包被0.8-1.2ml膠原蛋白，優選為1ml膠原蛋白。

步驟(2)中，接種的間充質干細胞懸液的濃度為1×10⁵～1.5×10⁵個細胞/孔。

步驟(2)中，培養采用的培養基為用于造血干細胞培養的無血清培養基。

其中，所述無血清培養基培養為SFEM無血清培養基。

SFEM無血清培養基，購自stem cell公司。

本發明還提供了前述方法制備得到的滋養層。

本發明還提供了前述滋養層在培養造血干細胞中的用途。

本發明造血干細胞的培養方法，它是以前述滋養層為滋養層進行培養。

優選地，所述培養方法的步驟如下：取前述的滋養層，接種造血干細胞，加入無血清培養基，培養即可；所述無血清培養基是每1ml添加有50-100ngSCF、25-50ng TPO、10-50ng Flt-3L的SFEM無血清培養基。

本發明方法制備的滋養層，能夠為造血祖干細胞(HSPC)的體外擴增提供有力的支持作用，顯著提高HSPC的擴增效率，能夠極大程度的緩解HSPC不足的問題，應用前景良好。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1本發明制備的MSC滋養層細胞增殖和細胞形態情況

圖2本發明制備的MSC滋養層細胞在共培養12天后的存活率情況

圖3本發明制備的MSC滋養層共培養的造血干祖細胞在擴增12天后的情況

具體實施方式

主要儀器及試劑：

SFEM 無血清培養基，購自stem cell公司貨號09650；

造血干細胞培養基：SFEM無血清培養基，購自stem cell公司；

SCF 干細胞生長因子

TPO 促血小板生成素

FLT-3 配體 FMS樣酪氨酸激酶配體

以上三種細胞因子購自Peprotech公司；

胰酶，購自gbico公司；