[發(fā)明專利]一種細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710072813.5
• 申請(qǐng)日: 2017-02-10
• 公開（公告）號(hào): CN106818710A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳晨;林科佳;馬冬磊;羅曉玲;魏志璋;王宇環(huán);魏宗科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市合一康生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02;C12N5/078;C12N5/0783
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• 代理人: 暫無信息

1.一種細(xì)胞凍存液，包括組分及體積百分?jǐn)?shù)：

無血清培養(yǎng)基的體積百分比為0%～50%，

自體血漿的體積百分比為40%～90%，

DMSO的體積百分比為5%～10%，

海藻糖的體積百分比為5%～10%；

各組分之和為100%。

2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液的配制方法，包括步驟：

1）海藻糖和DMSO按1：1的比例混勻，將自體血漿加入到無血清培養(yǎng)基中，使自體血漿的體積百分比為50%～100%，

2）將10%～20%的海藻糖和DMSO混合液緩慢加入，得到細(xì)胞凍存液。

3.一種提高外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存后再培養(yǎng)活性的方法，包括以下步驟：

1）采集外周血，分離上層淡黃色血漿層，并于56℃滅活15-30min，900-1200g離心5-10min，剩余的液體即為濃縮的血細(xì)胞，用生理鹽水稀釋濃縮的血細(xì)胞至原體積；

2）將細(xì)胞分離液加入離心管的底部，將步驟1)中的血液稀釋液緩慢的加到細(xì)胞分離液上層，血液稀釋液與細(xì)胞分離液的體積比為2:1，600-700g離心15-20min，吸取離心管內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞層，移到離心管內(nèi)并補(bǔ)加生理鹽水，洗滌并離心收集外周血單個(gè)核細(xì)胞；

3) 外周血單個(gè)核細(xì)胞的凍存：將步驟2)收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞利用自體血漿重懸，向制得的細(xì)胞懸液中加入權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凍存液，搖勻分裝至凍存管中，放入程序降溫盒中，轉(zhuǎn)至-80℃后，后轉(zhuǎn)移至液氮罐；

4) 外周血單個(gè)核細(xì)胞的復(fù)蘇：將步驟3)凍存的凍存管從氣相液氮罐中取出，水浴溶解后將凍存管中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至復(fù)蘇保護(hù)液中，細(xì)胞懸液與復(fù)蘇保護(hù)液的體積比為1：5-10，混勻后洗滌離心，將洗滌離心后的外周血單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶中；

5) 外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)：對(duì)步驟4)中培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞懸液進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)。

4.如權(quán)利要求書3所述的提高外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存后再培養(yǎng)活性的方法，其特征是：所述步驟3)的凍存過程具體為：將步驟2)收集的外周血單個(gè)核細(xì)胞用自體血漿重懸，再將上述細(xì)胞凍存液緩慢加入到細(xì)胞懸液中，細(xì)胞凍存液中無血清培養(yǎng)基、自體血漿與DMSO和海藻糖混合液的體積比為0：4：1；凍存的細(xì)胞密度為5×106 /mL。

5.如權(quán)利要求3所述提高外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存后再培養(yǎng)活性的方法，其特征是：步驟4）所述復(fù)蘇保護(hù)液為1640培養(yǎng)基+5%人血清白蛋白，或者為PBS緩沖液+5%人血清白蛋白，或者為注射用生理鹽水+5%人血清白蛋白。

6.如權(quán)利要求3所述的提高外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存后再培養(yǎng)活性的方法，其特征是：所述步驟4)的凍存管從氣相液氮罐中取出后，置于37℃恒溫水浴中，并迅速溶解，轉(zhuǎn)移至復(fù)蘇保護(hù)液中，混勻后500g離心10min；培養(yǎng)瓶中接種的細(xì)胞密度為0.5×10⁶/mL。

7.如權(quán)利要求書3所述的提高外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存后再培養(yǎng)活性的方法，其特征是：還包括步驟：

6）向步驟4)的細(xì)胞懸液中添加IFN-γ細(xì)胞因子，使終濃度為200～1000U/mL，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，并按總體積10-15％的量添加自體血漿；

7）培養(yǎng)18-24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并添加細(xì)胞因子CD3、CD28、IL-2，使終濃度分別為300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，混勻，放置于 CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

8）之后每隔2天補(bǔ)加一次免疫細(xì)胞培養(yǎng)基和200～2000U/mL IL-2，并計(jì)數(shù)，補(bǔ)充培養(yǎng)基后使細(xì)胞密度保持在0.2～1.2×10⁶cell/mL；

9）連續(xù)培養(yǎng)10-14天。