[發明專利]一種從蛹蟲草子實體上快速分離培養單孢的方法

在審

• 申請號: 201710071453.7
• 申請日: 2017-02-09
• 公開（公告）號: CN106591213A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 喬鵬;田偉;李化秀;施新琴;顧寅鈺
• 申請（專利權）人: 山東省蠶業研究所
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 張宏松

技術領域

本發明屬于生物科學領域，特別涉及一種從蛹蟲草子實體上快速分離培養單孢的方法。

背景技術

蛹蟲草Cordyceps militaris作為一種蟲生真菌具有多種藥用功效，在醫療保健領域具有廣闊的應用前景。盡管在人工培養、菌種選育、分子生物學、活性成分等方面已經對蛹蟲草做了大量研究工作，但菌種退化在人工栽培方面還存在明顯的技術難題。

在蛹蟲草培養研究中，優良菌種的選育和高產培養條件的研究仍是蛹蟲草研究的重點。有研究表明，蛹蟲草菌多孢菌株(包括多子囊孢子菌株和多分生孢子菌株)或組織分離來源的菌株在相同條件下產子實體的能力經常發生變化；多孢菌株或組織分離菌株比單孢菌株更容易發生菌種退化。

現有的蛹蟲草菌種選育時，獲取孢子后，一般通過平板劃線和涂布的方法，以將孢子稀釋到合適的程度，待菌落形成后，作進一步的挑選。這種選育方法雖然操作簡單，但是由于技術本身的限制，難以獲得單孢生長形成的菌落，獲得的菌落需要進行進一步的分離和挑選。這一方法需要進行大量的重復性勞動，分離效率低，選育耗時長，難以滿足生產的需要。

因此通過技術創新，快速分離培養獲得大量單孢菌株，對蛹蟲草的栽培具有重要的理論和實踐意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種從蛹蟲草子實體上快速分離培養單孢的方法。

本發明是通過如下技術方案實現的：

一種從蛹蟲草子實體上快速分離培養單孢的方法，包括步驟如下：

(1)向帶有密封蓋的培養管加水、滅菌，得滅菌水，干燥密封蓋，備用；

(2)取距蛹蟲草子實體頂部1/2～1/3區域內部位，分割成數段，每段蟲草子實體的長度小于密封蓋的內徑；

(3)取其中一段蟲草子實體，粘貼在干燥密封蓋上，倒懸在滅菌水上方，閉蓋，于20～25℃條件下培養24～48h，待蟲草子實體上的孢子彈落滅菌水中形成孢子懸浮液；

(4)將PDA培養基倒入培養皿中，制得平板培養基，吸取孢子懸浮液轉移至平板培養基上，涂抹均勻，置于溫度20～25℃下黑暗倒置培養12小時以上；

(5)另外取PDA培養基裝入干凈的培養管中，滅菌后備用；

(6)將步驟(4)的培養皿置于體式鏡下，觀察尋找單個萌發的孢子，挑取萌發的孢子，轉移至步驟(5)中的培養管中，于18～22℃條件下閉蓋培養；獲得單孢培養物。

本發明優選的，步驟(1)、步驟(5)的培養管為帶蓋的離心管，離心管規格為1.5ml或2ml，滅菌水為1ml。

本發明優選的，步驟(1)、步驟(5)中滅菌溫度為120～125℃，滅菌時間10～30min，優選的，滅菌溫度為121℃，滅菌時間20min。

本發明優選的，步驟(2)取距蛹蟲草子實體頂部2/5～1/3區域內部位進行分割，最為優選的，取距蛹蟲草子實體頂部1/3區域內部位進行分割。

本發明優選的，步驟(2)每段蟲草子實體的長度為5～7mm。

本發明優選的，步驟(3)中的粘貼方式為通過凡士林將蟲草子實體粘貼在密封蓋上，優選的，將凡士林涂抹于蟲草的端部，然將其倒掛在密封蓋上。

本發明優選的，步驟(3)蟲草子實體粘貼在干燥密封蓋的內側中央位置。

本發明優選的，步驟(4)中的PDA培養基加入氯霉素或土霉素，加入量為0.1～0.3g/L，優選的，加入量為0.2g/L。抑制細菌的生長，減少干擾。

本發明優選的，步驟(4)中每1cm²培養基上涂抹0.1～0.3μl孢子懸浮液。

本發明優選的，步驟(4)中直徑為8cm的培養皿加入10μl孢子懸浮液，用涂棒涂抹均勻。

本發明優選的，步驟(4)黑暗倒置培養溫度為22～24℃，培養時間為18～24h。

本發明優選的，為進一步檢驗該方法所獲得的單孢培養物的可信度，該方法還包括，對步驟(6)獲得的單孢培養物進行擴繁后提取DNA，然后進行MAT基因檢測，若只擴增出一種交配基因的片段，該培養物為單孢培養物，否則不是單孢培養物。

MAT基因檢測具體步驟及核苷酸序列參見“交配型基因作為分子標記鑒定蛹蟲草退化菌株的核相初步研究”，汪虹，魏靜等，食用菌學報@2010.17(4)：1～4，正文第2頁。

上述擴繁按本領域的常規技術進行。

本發明的孢子懸浮液轉移、單個萌發的孢子的轉移使用滅菌的移液槍及10μl槍頭進行。

本發明具有如下優點：