[發明專利]一種即用型的核酸磁珠提取試劑

在審

• 申請號: 201710068589.2
• 申請日: 2017-02-08
• 公開（公告）號: CN107043766A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 周科隆;徐添明
• 申請（專利權）人: 上海紐思格生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于一種生物技術核酸提取純化領域，特別是涉及一種微量的病毒核酸提取純化試劑及其使用方法，尤其是人體體液如血清、血漿、全血、尿液、腦脊液等樣本中的核酸提取。

背景技術

核酸的分離與純化技術是生化與分子生物學的一項基本技術，核酸是遺傳信息的攜帶者，是蛋白表達的物質基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離純化。目前核酸分離技術雖然發展迅速，但是均存在一些缺點：經典的酚氯仿抽提法，雖然核酸得率高，但其對人體有害，且容易造成環境污染，同時提取過程需要反復抽提，多次高速離心換管，步驟繁瑣，會造成樣本的丟失與交叉污染。堿裂解法:該法操作相對簡單，但提取的核酸不容易保存，純度低且不能用于RNA提取。硅膠膜吸附柱法：操作簡便易于標準化，提取的核酸DNA/RNA純度高得率高，但難于實現自動化、成本高、單位時間的提取通量低、提取的核酸片段不夠完整(條件劇烈導致斷裂較多)。

磁珠是由四氧化三鐵或三氧化二鐵等磁性粒子與各種含功能基團的二氧化硅材料復合而成的球形微粒，磁珠表面可被賦予多種活性功能基團，如羧基、羥基等，也可共價結合寡聚核苷酸、酶、細胞、抗體等生物活性物質。磁珠在磁場條件下可以發生聚集或分散，當粒徑處于一定范圍時，具有很好的瞬時響應性，即超順磁性，可避免發 生磁團聚，可在外加磁場作用下被定位、導向和分離。表面結合的基團或活性物質可以特異吸附核酸或其他生物大分子，并在磁場作用下達到分離純化生物大分子的作用。

當前，磁珠已在核酸提取純化中得以廣泛應用，然而絕大多數商售的磁珠法核酸提取試劑盒存在缺點：提取效率低(與QIAGEN或Roche的硅膜吸附柱法比較明顯遜色)，操作步驟繁瑣(宣稱自動化、實際操作卻涉及多次人工干預并且無法從試劑角度避免)，不是即用型試劑(用戶使用前需要加入乙醇或異丙醇等，還需要復溶蛋白酶，載體核酸或助沉劑等)。這些缺點限制了磁珠試劑的大規模應用，用戶并沒有獲得比傳統吸附柱法更好的結果，與其它方法比較，除了可以自動化之外幾乎沒有其它優點，當前磁珠法的現狀是，用戶多一種選擇，僅此而已。

發明內容

本發明致力于開發一種操作簡捷、可自動化、可標準化的即用型磁珠法核酸提取試劑，并提供其大規模工業化制造的方法。該試劑盒操作簡便，提取核酸片段完整、純度高，得率高，適用于雜交分析、測序、PCR、電泳、基因芯片等分子克隆等下游實驗。其組分如下:①裂解結合液、②磁珠懸液、③洗滌液A、④洗滌液B、⑤洗脫液。所述裂解結合液為含有表面活性劑的異硫氰酸胍/硫氰酸胍/鹽酸胍溶液，并含乙醇/異丙醇的緩沖液。優選的是2M-5M GuSCN，20-200mM檸檬酸鈉-檸檬酸，2％-20％Triton X-100，1-6％Thesit，0.1-1％SDS，10-30％乙醇，所述裂解液的pH值＝6-7；所述洗滌液A，優選的是 30％-60％乙醇、1-2M GuSCN、1-20mM Tris；所述洗滌液B優選的是60％-80％乙醇、10-100mM NaCl和1-20mM Tris；所述洗脫液含有10mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH值＝8.0或者純水；所述磁珠懸浮液優選的是磁珠含量為20-100mg/ml，磁珠顆粒直徑為直徑在0.1-2.5μM。

上述的磁珠法核酸提取試劑的提取方法，包括以下步驟:

1)在一次性塑料耗材中加入含有磁珠及內標的工作裂解結合液500-800μl，加入樣本200μl，吸打混勻一次，使樣本裂解釋放出DNA/RNA，并結合到磁珠上，10-15分鐘結合充分后，在磁場作用下，磁珠富集，磁珠-核酸復合物與液體分離。

2)向磁珠-核酸復合物加入800-1000μl洗滌液A，洗去復合物表面蛋白質、脂類以及鹽離子等雜質，在磁場作用下，得到洗滌后的復合物。

3)向磁珠-核酸復合物加入800-1000μl洗滌液B，洗去復合物表面胍鹽及離子雜質，在磁場作用下，得到洗滌后的復合物；

4)向洗滌后的磁珠-核酸復合物加入60-100μl洗脫液，改變磁珠和核酸結合情況，將核酸在磁珠上面洗脫下來，約需5分鐘，在磁場作用下，磁珠和核酸分離，得到純化的DNA/RNA。

本試劑盒適用的樣本包括血清、血漿、全血、組織提取液、拭子 洗液、分泌物浸泡液、糞便預處理液、病毒培養液和其他體液等。本發明所提取的核酸可直接進行PCR及RT-PCR等分子生物學實驗研究以及臨床檢測。本試劑盒可配合自動化儀器提取病毒核酸。速度快，通量高。以下實施例僅僅是例證，本發明并不局限于這些實施例。

附圖說明：