[發明專利]鑒別栽培黑麥與野生黑麥染色體的分子檢測方法

有效

• 申請號: 201710067844.1
• 申請日: 2017-02-07
• 公開（公告）號: CN106755507B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 楊足君;李光蓉;郎濤;張潔;王宏晉
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種鑒別黑麥野生型和栽培型的分子標記的分子探針組合，其特征在于，所述分子探針組合為分子探針序列pSa193和分子探針序列pSyCTT，所述分子探針序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探針序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的分子標記的分子探針組合，其特征在于，所述分子探針序列pSa193和分子探針序列pSyCTT均帶有5’FAM熒光標記，使用時探針pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。

3.一種鑒別黑麥野生型和栽培型的分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、制備黑麥染色體標本：

步驟2、制備分子探針、工作液和雜交液：

步驟3、原位雜交：

步驟4、比對；

所述步驟2中的制備分子探針、工作液和雜交液具體為：

所述分子探針用由生物公司利用5’末端FAM熒光標記法合成寡核苷酸序列，具體為分子探針序列pSa193和分子探針序列pSyCTT，分子探針序列pSa193和分子探針序列pSyCTT均帶有5’FAM熒光標記，純化后用1xTE、pH8.0的Tris-EDTA緩沖液溶解，利于探針長期保存；使用時探針pSa193和pSyCTT按10:1比例混合；所述分子探針序列pSa193的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述分子探針序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示；

工作液是通過4SSc和2xTE的1:1混合，最終濃度為2SSC 1xTE，pH7.0；-20℃保存備用；

雜交液為2SSC 1xTE，pH7.0的溶液。

4.根據權利要求3所述的鑒別黑麥野生型和栽培型的分子標記方法，其特征在于，所述步驟1中的制備黑麥染色體標本具體為：

步驟1.1、將種子放于浸潤了雙蒸水的培養皿中，放于恒溫于22-24℃的培養箱中培養；待種子萌動后，放置于4℃冰箱內，使種子萌發同步，24小時后將種子上發芽梳，在22-24℃培養箱中培養；培養至種子根長至1-2cm時，剪根；

步驟1.2、將剪下的根放在噴了蒸餾水的0.5ml離心管中，離心管的蓋子上戳一透氣孔，一氧化二氮處理2小時；

步驟1.3、用體積濃度為90％的醋酸固定8分鐘，蒸餾水清洗3次或者加入70％酒精放-20℃保存；

步驟1.4、用濾紙將根尖上的水稍微吸干，將根尖分生組織切下，放入酶中，37℃水浴1小時；

步驟1.5、用體積分數為70％的酒精洗2次，洗第二次時留一點酒精在離心管里，用解剖針將根尖搗碎，于2000轉/分的轉速下離心10秒，盡量將酒精倒干，加100％乙酸，每個根尖20μl，用移液槍反復吸打混勻；

步驟1.6、將載玻片放在濕潤的盒子里，每片滴7μl細胞懸液，蓋上盒蓋，5分鐘后鏡檢，制備得到制備黑麥染色體標本。

5.根據權利要求3所述的鑒別黑麥野生型和栽培型的分子標記方法，其特征在于，所述步驟3中的原位雜交具體為：

步驟3.1、將合成的探針各0.3ul加入8.0ul的2XSSC 1xTE、pH7.0的雜交液之中；每張玻片加雜交液后，輕輕蓋上蓋玻片，在37℃濕盒中，雜交3小時以上或過夜；

步驟3.2、將雜交的玻片取出，立即放在2xSSc溶液工作液中，蓋玻片會自動脫落；浸泡2分鐘；取出玻片用洗耳球吹干；

步驟3.3、加4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，即在熒光顯微鏡下觀察照相。

6.根據權利要求3所述的鑒別黑麥野生型和栽培型的分子標記方法，其特征在于，所述步驟4中的比對具體為：利用熒光顯微鏡，通過載玻片上野生和栽培黑麥的染色體標本，在480nm至500nm波長的熒光激發下，以藍色熒光為背景，觀察野生黑麥染色體端部，具有4-20個綠色的熒光信號的為野生黑麥，具有2個以下綠色的熒光信號的為栽培黑麥。