[發明專利]一種臍帶間充質干細胞的分離及培養方法

在審

• 申請號: 201710067279.9
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106754686A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張鳳寧
• 申請（專利權）人: 貴州泛特爾細胞生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙)11504
• 代理人: 宋林清

技術領域

本發明涉及間充質干細胞領域，更具體的，涉及一種臍帶間充質干細胞的分離及培養方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種能夠自我更新，具有多向分化潛能的祖細胞。在成骨不全、造血功能不全、骨組織的再生等疾病的治療中，均可分化為相應終端分化細胞。在再生醫學治療領域，以間充質干細胞為基礎的細胞治療方法由于其自我更新和多向分化的潛能，越來越受到人們的青睞。從臍帶中也可以分離MSCs很早就已經被J.W.Kim等人證明，帶標本中不僅能夠分離得到了MSCs，而且也通過成脂誘導，成骨誘導驗證了MSCs具有分化潛能，對MSCs的分離及培養是臍帶間充質干細胞得以良好應用的重要保證，目前大多數MSCs的分離及培養方法難以實現規模化生產。

中國專利文獻公開號CN103421739A公開了一種高效分離臍帶間充質干細胞的方法，使用插管分離臍帶間充質干細胞以及使用trypLETM消化和無血清培養基培養臍帶間充質干細胞的步驟。本發明雖然能夠更快的得到完全來自母體的臍帶間充質干細胞，而且對細胞的損傷更小，但其培養方式簡單，不適合大規模生產，加工效率有限，工業化生產前景局限。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明所要解決的技術問題在于提出一種臍帶間充質干細胞的分離及培養方法，其采用組織塊法對膠體進行分離，能夠獲得數量可觀的原代細胞，適合大規模工業化生產。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了一種臍帶間充質干細胞的分離及培養方法，按如下步驟實施：

SOO:膠體分離步驟：從采集瓶內取出臍帶，測量所述臍帶長度并記錄，對所述采集瓶內部的保存液進行支原體檢測；將所述臍帶移送至無菌培養皿內，對所述臍帶進行沖洗及去血漬并將所述臍帶裁剪成數段；剔除所述臍帶內部的血管及羊膜；從所述臍帶中分離出華通氏膠，對所述華通氏膠進行洗滌；

S10：組織塊制備步驟：將所述華通氏膠轉移至離心管，對所述華通氏膠進行離心處理；對所述離心管內部的洗滌液進行無菌檢測，并對所述華通氏膠進行稱重；向所述華通氏膠內部加入用于培養臍帶充質細胞的專用培養基；將所述華通氏膠剪切成組織塊，其與所述專用培養基混合后，形成組織塊勻漿；

S20：接種處理步驟：依據所述華通氏膠的重量繼續加入適量所述專用培養基，直至所述組織塊勻漿的濃度與預設濃度保持一致；采用電動移液器對所述組織塊勻漿進行吹打，使其均勻混合；將所述組織塊勻漿分成若干份，分別加入若干培養瓶內進行接種，并在若干所述培養瓶內加入所述專用培養基；

S30：原代細胞培養及收獲步驟：平置所述培養瓶使得所述組織塊勻漿均勻分布于所述培養瓶的底部；將所述培養瓶置于含有二氧化碳且恒溫恒濕的培養箱內；對所述培養瓶內部的所述專用培養基進行換液處理；當所述培養瓶內部的細胞克隆團的面積百分比與預設面積百分比一致時，向所述培養瓶內加入消化酶進行消化處理；反復吹打瓶底直至所述細胞克隆團脫離，并將所述細胞克隆團轉移至定容離心管內，加入適量的氯化鈉注射液并吹打懸浮液，直至所述離心管內部的細胞濃度與預設濃度保持一致；對所述定容離心管內部的混合物進行過濾，并將濾液收集至所述定容離心管內；

S40：原代細胞傳代步驟：觀察裝有原代細胞單個所述離心管內部的余下細胞沉淀量，依據所述余下細胞沉淀量合并多個所述離心管的內容物至一個離心管內；加入適量的氯化鈉注射液并吹打重懸浮細胞，直至所述離心管內部的細胞濃度與預設濃度保持一致。去除所述離心管內部的上清液，在所述離心管內部加入所述專用培養基并吹打重懸浮細胞，在所述離心管內進行定容后依據S30步驟接種至所述培養瓶；

S50：細胞傳代步驟：當傳代細胞的融合度與預設融合度一致時，向所述培養瓶內加入消化酶進行消化處理；反復吹打瓶底直至所述細胞克隆團脫離，并將所述細胞克隆團轉移至定容離心管內，加入適量的氯化鈉注射液并吹打懸浮液，直至所述離心管內部的細胞濃度與預設濃度保持一致；去除所述離心管內部的上清液，在所述離心管內部加入所述專用培養基并吹打重懸浮細胞，在所述離心管內進行定容后依據S30步驟接種至所述培養瓶。