[發(fā)明專利]一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710067279.9
• 申請日: 2017-02-06
• 公開（公告）號: CN106754686A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鳳寧
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州泛特爾細(xì)胞生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京力量專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11504
• 代理人: 宋林清

1.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于，按如下步驟實施：

SOO:膠體分離步驟：從采集瓶內(nèi)取出臍帶，測量所述臍帶長度并記錄，對所述采集瓶內(nèi)部的保存液進(jìn)行支原體檢測；將所述臍帶移送至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，對所述臍帶進(jìn)行沖洗及去血漬并將所述臍帶裁剪成數(shù)段；剔除所述臍帶內(nèi)部的血管及羊膜；從所述臍帶中分離出華通氏膠，對所述華通氏膠進(jìn)行洗滌；

S10：組織塊制備步驟：將所述華通氏膠轉(zhuǎn)移至離心管，對所述華通氏膠進(jìn)行離心處理；對所述離心管內(nèi)部的洗滌液進(jìn)行無菌檢測，并對所述華通氏膠進(jìn)行稱重；向所述華通氏膠內(nèi)部加入用于培養(yǎng)臍帶充質(zhì)細(xì)胞的專用培養(yǎng)基；將所述華通氏膠剪切成組織塊，其與所述專用培養(yǎng)基混合后，形成組織塊勻漿；

S20：接種處理步驟：依據(jù)所述華通氏膠的重量繼續(xù)加入適量所述專用培養(yǎng)基，直至所述組織塊勻漿的濃度與預(yù)設(shè)濃度保持一致；采用電動移液器對所述組織塊勻漿進(jìn)行吹打，使其均勻混合；將所述組織塊勻漿分成若干份，分別加入若干培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行接種，并在若干所述培養(yǎng)瓶內(nèi)加入所述專用培養(yǎng)基；

S30：原代細(xì)胞培養(yǎng)及收獲步驟：平置所述培養(yǎng)瓶使得所述組織塊勻漿均勻分布于所述培養(yǎng)瓶的底部；將所述培養(yǎng)瓶置于含有二氧化碳且恒溫恒濕的培養(yǎng)箱內(nèi)；對所述培養(yǎng)瓶內(nèi)部的所述專用培養(yǎng)基進(jìn)行換液處理；當(dāng)所述培養(yǎng)瓶內(nèi)部的細(xì)胞克隆團(tuán)的面積百分比與預(yù)設(shè)面積百分比一致時，向所述培養(yǎng)瓶內(nèi)加入消化酶進(jìn)行消化處理；反復(fù)吹打瓶底直至所述細(xì)胞克隆團(tuán)脫離，并將所述細(xì)胞克隆團(tuán)轉(zhuǎn)移至定容離心管內(nèi)，加入適量的氯化鈉注射液并吹打懸浮液，直至所述離心管內(nèi)部的細(xì)胞濃度與預(yù)設(shè)濃度保持一致；對所述定容離心管內(nèi)部的混合物進(jìn)行過濾，并將濾液收集至所述定容離心管內(nèi)；

S40：原代細(xì)胞傳代步驟：觀察裝有原代細(xì)胞單個所述離心管內(nèi)部的余下細(xì)胞沉淀量，依據(jù)所述余下細(xì)胞沉淀量合并多個所述離心管的內(nèi)容物至一個離心管內(nèi)；加入適量的氯化鈉注射液并吹打重懸浮細(xì)胞，直至所述離心管內(nèi)部的細(xì)胞濃度與預(yù)設(shè)濃度保持一致。去除所述離心管內(nèi)部的上清液，在所述離心管內(nèi)部加入所述專用培養(yǎng)基并吹打重懸浮細(xì)胞，在所述離心管內(nèi)進(jìn)行定容后依據(jù)S30步驟接種至所述培養(yǎng)瓶；

S50：細(xì)胞傳代步驟：當(dāng)傳代細(xì)胞的融合度與預(yù)設(shè)融合度一致時，向所述培養(yǎng)瓶內(nèi)加入消化酶進(jìn)行消化處理；反復(fù)吹打瓶底直至所述細(xì)胞克隆團(tuán)脫離，并將所述細(xì)胞克隆團(tuán)轉(zhuǎn)移至定容離心管內(nèi)，加入適量的氯化鈉注射液并吹打懸浮液，直至所述離心管內(nèi)部的細(xì)胞濃度與預(yù)設(shè)濃度保持一致；去除所述離心管內(nèi)部的上清液，在所述離心管內(nèi)部加入所述專用培養(yǎng)基并吹打重懸浮細(xì)胞，在所述離心管內(nèi)進(jìn)行定容后依據(jù)S30步驟接種至所述培養(yǎng)瓶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：

在SOO步驟中，采用無菌鑷子將所述臍帶移送至10cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入5～10ml氯化鈉注射液對所述臍帶進(jìn)行沖洗，重復(fù)2～3次，接著采用將無菌手術(shù)剪將所述臍帶裁剪成2～3cm數(shù)段，并加入5～10ml氯化鈉注射液洗滌所述臍帶上的血凝塊，重復(fù)洗滌；從所述臍帶中分離出華通氏膠，加入5～10ml氯化鈉注射液對所述華通氏膠進(jìn)行洗滌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：

在S1O步驟中，將所述華通氏膠轉(zhuǎn)移至50ml離心管，加氯化鈉注射液20～30ml輕輕晃動，并離心處理，處理參數(shù)為840g，5min；向所述華通氏膠內(nèi)部加入1～2ml專用培養(yǎng)基；采用無菌長柄手術(shù)剪將所述華通氏膠剪切成組織塊，其與所述專用培養(yǎng)基混合后，形成1～4mm³組織塊勻漿。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：

在S2O步驟中，所述預(yù)設(shè)濃度為0.4～0.6g/ml；所述培養(yǎng)瓶的型號配置為T75，在T75培養(yǎng)瓶內(nèi)部加入0.5g華通氏膠體及10ml所述專用培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：

在S3O步驟中，原代細(xì)胞培養(yǎng)5～6天，所述培養(yǎng)瓶內(nèi)部的所述專用培養(yǎng)基呈淺黃色時，對所述培養(yǎng)瓶內(nèi)部的所述專用培養(yǎng)基進(jìn)行全量換液處理；原代細(xì)胞培養(yǎng)9～10天，對所述培養(yǎng)瓶內(nèi)部的所述專用培養(yǎng)基進(jìn)行半量換液處理。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：

所述培養(yǎng)箱內(nèi)部的二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5±0.2％，所述培養(yǎng)箱內(nèi)部的培養(yǎng)溫度為37±0.5℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：

在S4O步驟中，依據(jù)所述余下細(xì)胞沉淀量合并多個所述離心管的內(nèi)容物至一個離心管內(nèi)，離心管定容為30ml；對離心管內(nèi)部的內(nèi)容物進(jìn)行二次離心，離心處理參數(shù)為210g，10min；

所述培養(yǎng)瓶內(nèi)部的傳代細(xì)胞密度為5000～6000個/cm²。