[發明專利]一種基于RbsB信號肽的雙功能DNA元件及其應用

有效

• 申請號: 201710060002.3
• 申請日: 2017-01-24
• 公開（公告）號: CN106636165B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 張臣良;張婷;曾鳴;何金燕;王小軍;劉聰;姜長安
• 申請（專利權）人: 成都分子脈象生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70
• 代理公司: 11212 北京輕創知識產權代理有限公司
• 代理人: 楊立;張帆<國際申請>=<國際公布>=<

本發明涉及一種基于RbsB信號肽的雙功能DNA元件及其應用，其序列如SEQ ID NO:1所示，或者為該序列的同義突變體，并且所述同義突變體的第16?36位核苷酸未發生突變。本發明還涉及包括該雙功能DNA元件的雙啟動子DNA元件和蛋白表達系統。通過在本發明的雙功能DNA元件上游安置一個大腸桿菌的誘導型啟動子，而在該元件下游連接需表達的外源基因序列，即可在大腸桿菌中表達外源蛋白，并可使用不同誘導條件分別將該蛋白表達在細胞質或周質空間里。該DNA構建體使研究人員能通過構建一種表達載體，而不需要分別構建細胞質和周質空間表達載體，就能比較兩種表達方式的優劣。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，更特別地涉及一種基于RbsB信號肽的雙功能DNA元件及其應用，以及包括該雙功能DNA元件的雙啟動子DNA元件和蛋白表達系統。

背景技術

大腸桿菌是基因工程蛋白表達的常用菌之一。大腸桿菌具有極快的增殖速度和高效的轉錄、翻譯能力,能夠在短時間內合成大量外源蛋白。目前多數基因工程蛋白表達系統都是將外源蛋白表達在大腸桿菌的細胞質里。如果所表達的蛋白質具有良好的可溶性和穩定性，一般工程菌在幾個小時內就能生產出與它們自身蛋白總量相當的外源蛋白。

雖然把外源蛋白表達在細菌的細胞質里能獲得極高的產量，但這種方法也存在缺點。一個問題是外源蛋白合成后必須在細菌的伴侶蛋白協助下才能折疊成構像正確、溶解性好、具有活力的蛋白，而細胞質里的伴侶蛋白是有限的，所以一旦所表達的外源蛋白不容易折疊，而細菌又不能提供足夠的伴侶蛋白進行協助時，那些折疊不正確的蛋白就會聚結在一起，在細胞質里形成不溶性的包涵體。另一個問題是細菌的細胞質是一個還原性的環境，不利于二硫鍵的形成，因此表達含有二硫鍵的外源蛋白時成功率很低。

除了細胞質，目前也有表達系統能在外源蛋白的N-端加上信號肽，將新合成的蛋白轉運到大腸桿菌細胞壁和細胞膜之間的空隙里，然后折疊成具有活力的蛋白。這個空隙，稱周質空間(Periplasm)，是一個氧化性較強的環境，能促進二硫鍵的形成，對含有二硫鍵的外源蛋白表達比較有利。另一方面，細菌也有限制周質空間蛋白合成速度的機制，能大幅度降低帶有信號肽的外源蛋白合成，避免無法正確折疊的外源蛋白在周質空間形成不溶性的包涵體。因此，雖然周質空間表達系統所表達的蛋白水平較低，但比較容易形成正確的三維構像。

由于細胞質和周質空間表達系統各有利弊，人們在表達外源蛋白時往往都需要分別嘗試，然后決定采用哪一條途徑。目前這兩種表達系統的質粒載體并不兼容。以MerckSigma公司(原EMD Millipore公司)的pET系列表達載體為例，其中pET23、pET28是細胞質表達載體，而pET22是周質空間表達載體。這些載體里，控制外源基因表達的都是T7啟動子。將克隆有外源基因的表達載體轉化到含有T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase，簡稱T7RNP)基因的菌株，如BL21(DE3)里，可以通過在菌液里加入IPTG誘導T7RNP的表達，從而激活載體中的T7啟動子，導致外源基因的表達。這些載體的差別在于pET22載體的外源基因上游含有編碼細菌pelB蛋白的信號肽序列，而pET23、pET28載體里沒有。這一差別決定了所表達外源蛋白的最終定位在周質空間還是細胞質。

雖然建立一種既可以將外源蛋白表達在細胞質，也可以轉運到周質空間的細菌表達載體能明顯降低蛋白表達中條件優化階段的工作量，但目前還沒有成功的例子。其難度在于周質空間表達載體必須含有信號肽編碼序列，而且該序列必須設計在外源基因的上游才能起作用，但這種安排也使該表達載體很難被用來表達不含有信號肽、在細胞質里積累的外源蛋白。

發明內容

發明人在研究過程中，通過突變大腸桿菌核糖結合蛋白(Ribose-bindingProtein，簡稱RbsB)基因的信號肽編碼區域，獲得了含有T7啟動子的嵌合信號肽編碼序列(簡稱T7SP)。這個特殊的T7SP序列不僅能編碼具有正常功能的信號肽，同時也是T7啟動子，能被T7 RNA聚合酶(T7RNP)所識別，激活下游基因的轉錄表達。