[發明專利]無創產前胎兒αSEA型地貧基因突變檢測文庫構建方法、檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201710044342.7
• 申請日: 2017-01-19
• 公開（公告）號: CN106755484A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 王曉鋒;曾華萍;宋卓
• 申請（專利權）人: 人和未來生物科技（長沙）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司44281
• 代理人: 孫銀行,彭家恩

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，尤其涉及一種無創產前胎兒α^-SEA型地貧基因突變檢測文庫構建方法、檢測方法和試劑盒。

背景技術

地中海貧血(簡稱地貧)是全世界的高發病率遺傳病之一，是由于人體基因突變或者缺失而導致α，β-珠蛋白肽鏈合成速率的不平衡，從而引起的溶血性貧血。地貧常見的兩種類型是α-地貧和β-地貧，α-地貧相關基因為HBA2和HBA1，β-地貧相關基因為HBB。地貧集中在熱帶和亞熱帶地區，多發生于地中海沿岸國家，其次為中東、印度、巴基斯坦、東南亞、中國南方和北非，美國是移民國家，其發生率也較高。我國長江以南各省是地貧高發區，廣東、廣西、海南、中國臺灣和香港等地受累人口超過2億。中國人群中，α-地貧的基因型別常見的有-α^SEA、-α3.7、-α4.2、α^CS、α^QS和α^WS，β-地貧常見的有26種基因突變型別。目前地貧尚無根治的方法，只能依靠傳統方法治療，即以輸血治療為主，價格昂貴，因此產前篩查和診斷對預防該種出生缺陷疾病具有重大意義。

1997年，盧煜明發現孕婦外周血漿中存在來自于胎兒的游離DNA，這一發現為通過孕婦外周血無創產前診斷和檢測胚胎基因型提供了新的可能，隨著高通量測序技術的應用，無創產前檢測胚胎染色體異常(如21、18、13染色體非整倍體變異)以及部分大的拷貝數變異已經成功應用于臨床產前篩查和診斷，但是孕婦體內胎兒游離DNA僅占孕婦血漿中總游離DNA的3％-6％，對于胎兒無創式的遺傳性疾病的檢測帶來挑戰。

不斷有研究人員嘗試通過孕婦外周血游離DNA對胎兒地貧基因做出檢測，由于孕婦外周血中存在大量母源游離DNA，所以如何有效區分胚胎基因的突變，對檢測方法的靈敏度提出了很高的要求。目前臨床報道產前檢測地貧基因突變的方法有幾種：傳統的羊膜穿刺、腹絨毛活檢等，由于是有創傷性的操作，可能伴有胎兒損傷、流產或宮內感染等風險。利用母體血漿中游離胎兒DNA的無創產前診斷也有些研究。Chiu RW通過使用實時熒光PCR技術實現了對父源codons 41/42 4bp缺失的有效檢測，還有科研工作者發展了針對其他β地貧點突變的檢測方法，但由于檢測突變多為點突變，方法的特異性有待提高。對于α地貧突變的研究也有報道，Warunee Tungwiwat等人，建立了基于熒光定量PCR檢測α⁰缺失的方法，然而該方法的靈敏度有待提高。此外，多種高靈敏度的技術方法也被嘗試用于無創地貧檢測，如質譜、數字PCR、COLD-PCR等。但這些基于單一位點的PCR技術的檢測方法存在一定的局限性，如血漿DNA低含量及高度片段化的特點，很可能會帶來PCR的假陰性。這種方法只能夠檢測與母親不同的特異性父源突變是否存在，而無法進一步確定母源突變的存在與否。基于高通量測序技術的孕婦血漿游離DNA的全基因組測序或者目標區域捕獲測序可以更加準確的實現對胎兒地貧基因的檢測，但全基因組測序的成本以及分析方法的復雜性和需要父母單體型等限制了在臨床上的應用；目標區域捕獲測序由于其目標區域捕獲效率低，僅能實現對胎兒α^SEA缺失純雜合型的區分，并且還存在分型錯誤的可能。鑒于此，需要提供一種高精確度的無創產前胎兒地貧基因突變檢測方法。

發明內容

本發明提供一種無創產前胎兒α^-SEA型地貧基因突變檢測文庫構建方法、檢測方法和試劑盒，能夠準確、高效地檢測α^-SEA型地貧基因突變，其結果與羊水穿刺檢測分型一致，但安全性、無創性和高效性方面明顯優于羊水穿刺檢測。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種無創產前胎兒α^-SEA型地貧基因突變檢測文庫構建方法，上述文庫用于通過高通量測序進行無創產前胎兒α^-SEA型地貧基因突變的檢測，上述方法包括：

(a)對母體外周血游離DNA連接帶有特異標簽序列和任選的樣本標簽序列的接頭序列；

(b)使用預文庫擴增引物序列對上一步的連接產物進行預文庫擴增，其中上述預文庫擴增引物序列與上述接頭序列互補結合；

(c)將上一步得到的預文庫分為上游預文庫和下游預文庫，分別使用上游特異性引物組1和下游特異性引物組1對上述上游預文庫和下游預文庫進行特異性擴增，分別得到上游特異性擴增產物1和下游特異性擴增產物1，