[發明專利]一種基于人工多酶生化反應網絡合成蛋白質的配方和方法

在審

• 申請號: 201710034697.8
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106834391A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 仰大勇;劉陽;周曉;張志昆;楊璐
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N15/63
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種基于人工多酶生化反應網絡合成蛋白質的配方和方法。

背景技術

進入21世紀，生命科學迅猛發展，生物學研究的重心逐漸由破譯或解釋基因遺傳信息轉移到基因生物學功能的研究，在分子層面上探索生命的奧秘。2005年人類基因組計劃測序工作全部完成，大量生物體的基因遺傳信息被解碼，而蛋白質是生物體進行基因功能活動的直接執行者，以基因遺傳信息為基礎的蛋白質功能研究變得尤為重要。蛋白質合成是蛋白質功能研究中最基本的環節，如何快速、簡便、高效地合成蛋白質成為共同關注的問題。

現階段，蛋白質傳統生物合成主要通過轉化或轉染的方式將目的基因導入宿主細胞，隨后利用細胞內的氨基酸殘基、核糖體及酶等必需物質和三磷酸腺苷等能量物質，在新的遺傳背景下進行穩定擴增和表達，完成蛋白質的合成。宿主細胞分為兩大系統，即原核細胞系統和真核細胞系統。原核細胞主要包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等屬于真核細胞，也常用于蛋白質合成。原核細胞系統具有生長速率快、轉化率高、成本低、易操作、可大規模培養等優點。但是仍存在一定的局限性，例如不能進行蛋白質的修飾，持續表達對宿主細胞產生毒害作用，易形成包涵體，蛋白質純化也比較困難。真核細胞系統具有一定的蛋白質翻譯后的加工修飾能力，接近真核生物蛋白質或天然蛋白質，克服了原核細胞系統的不足，具有許多優勢。但其產物蛋白不均一、形成多聚體、信號肽加工不完全、產量低、細胞培養成本高、技術復雜等是也是亟需解決的問題。蛋白質傳統生物合成較適用于對單個或幾個蛋白質的研究，而目前，高通量、大數據、快速高效研究已經成為蛋白質功能研究的趨勢，傳統方式已無法滿足研究要求，這就需要我們探索一種快速、高效、簡便地合成大量蛋白質的方法。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種無需細胞，方法簡便、廉價、可控和高產率的基于人工多酶生化反應網絡合成蛋白質的方法。

本發明的第二個目的是提供一種基于人工多酶生化反應網絡合成蛋白質的配方。

本發明的技術方案概述如下：

一種基于人工多酶生化反應網絡合成蛋白質的配方，包括：

1)用于蛋白質合成的細胞提取物；

2)用于蛋白質合成的外加反應物；

3)用于蛋白質合成的基因質粒。

用于蛋白質合成的細胞提取物包括比例為1g:0.01～0.1ml:1～3ml的細胞破碎產物、緩沖溶液1和緩沖溶液2；

所述緩沖溶液1為：5-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸鉀，10-20mmol/L谷氨酸鎂，0.5-2mmol/L二硫蘇糖醇，5-10mmol/L 2-巰基乙醇；溶劑是去離子水；

所述緩沖溶液2為：5-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸鉀，10-20mmol/L谷氨酸鎂，0.5-2mmol/L二硫蘇糖醇；溶劑是去離子水。

優選地：用于蛋白質合成的外加反應物由按體積比為(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反應緩沖液、能量補充液和濃度為5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液組成：

所述氨基酸混合液，溶劑為去離子水；每種氨基酸的濃度均為5-20mmol/L的等摩爾濃度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；

所述反應緩沖液包括：40-60mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸鉀、10-25mmol/L谷氨酸鎂、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L環磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/L輔酶A、0.4-0.8mmol/L亞葉酸、1.0-5.0mg/mL轉運核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亞精胺；溶劑是去離子水；

所述能量補充液包括：1.0-3.0mmol/L三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/L三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/L三磷酸鳥苷，溶劑是去離子水。

所述細胞為真核細胞或原核細胞。

一種基于人工多酶生化反應網絡合成蛋白質的方法，包括如下步驟：

將用于蛋白質合成的細胞提取物、用于蛋白質合成的外加反應物和用于蛋白質合成的基因質粒混合，置于恒溫反應容器中，在25-37℃放置10min-48h。