[發(fā)明專利]一種基因定點突變載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710030839.3
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106834341B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜臨建;陳其軍;倪漢文;許勇;陳易雨;王志平
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

1.一種基因定點突變載體，其特征在于，所述載體在基礎(chǔ)載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建，5’到3’包括啟動子、sgRNA、胞嘧啶脫氨酶基因、Cas9基因、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑基因和終止子；

所述sgRNA表達區(qū)含有植物除草劑所抑制的酶的相關(guān)基因的靶點序列；

用XTEN將胞嘧啶脫氨酶基因連接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑基因連接在Cas9基因的3’端，核定位信號序列連接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑基因的3’端，進行植物偏好密碼子的優(yōu)化，得到優(yōu)化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述基礎(chǔ)載體為PHEE401E，序列如SEQ IDNo.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述Cas9基因為D10A。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體為雙元載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述啟動子是植物內(nèi)的組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述胞嘧啶脫氨酶基因來自人類基因組，Cas9基因來自嗜熱鏈球菌，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑基因來自噬菌體。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述除草劑所抑制的酶的相關(guān)基因的靶點序列的胞嘧啶3`端方向23個堿基內(nèi)具有PAM序列NGG。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述植物為糧食和油料作物，包括水稻、棉花、玉米、小麥、大豆、油菜、向日葵；蔬菜作物，包括白菜、甘藍、黃瓜、番茄；水果作物，包括西瓜、甜瓜、草莓，藍莓，葡萄；中草藥，包括板藍根、甘草、人參、防風(fēng)；以及擬南芥；

所述植物除草劑所抑制的酶的相關(guān)基因為ALS。

9.一種基因定點突變載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)用XTEN將胞嘧啶脫氨酶基因連接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑基因連接在Cas9基因的3’端，核定位信號序列連接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑基因的3’端，進行植物偏好密碼子的優(yōu)化，得到優(yōu)化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示；

2)用步驟1)中CT3替換載體PHEE401E上的Cas9基因，所得載體命名為PHEE401CT；PHEE401E的序列如SEQ ID No.2所示；

3)將除草劑所抑制的酶的相關(guān)基因的靶點序列克隆到PHEE401CT中的sgRNA表達區(qū)，至此PHEE401CT載體構(gòu)建完成。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3)中除草劑所抑制的酶的相關(guān)基因為擬南芥ALS基因，序列如SEQ ID No.3所示。

11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述除草劑所抑制的酶的相關(guān)基因的靶點序列如SEQ ID No.4所示。

12.一種抗除草劑植物的制備，其特征在于，包括如下步驟：

將權(quán)利要求9所述的PHEE401CT載體轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌中，通過蘸花法轉(zhuǎn)化植株，通過噴施除草劑獲得具有除草劑抗性的植株。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體在植物靶點序列產(chǎn)生C-T的突變。

14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體還在PAM序列NGG處產(chǎn)生點突變，形成NGA，實現(xiàn)重大農(nóng)藝性狀。