[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)FFPE樣本DNA含量及完整性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710024016.X
• 申請(qǐng)日: 2017-01-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106755467B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李宗梅;夏赟;蔣智;師文霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津諾禾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6851
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 趙囡囡;金田蘊(yùn)

本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)FFPE樣本DNA含量及完整性的方法。該方法包括以下步驟：S1，根據(jù)FFPE樣本的內(nèi)參基因設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度為Mbp和Nbp的兩對(duì)引物，其中，MN；S2，取不同降解程度的樣本，使用qPCR方法進(jìn)行定量，并使用人全基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品采用擴(kuò)增Mbp產(chǎn)物的擴(kuò)增引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；S3，每個(gè)樣本分別采用上述兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)Mbp產(chǎn)物的濃度確定DNA的有效濃度，根據(jù)Mbp產(chǎn)物與Nbp產(chǎn)物的CT差值判斷DNA的降解程度；以及S4，根據(jù)樣本的檢測(cè)結(jié)果及建庫(kù)信息分析結(jié)果確定量化的判定標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠精準(zhǔn)測(cè)定FFPE DNA的有效濃度，并且量化其降解程度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種檢測(cè)FFPE樣本DNA含量及完整性的方法。

背景技術(shù)

FFPE為福爾馬林固定、石蠟包埋的樣本。這類(lèi)病理樣本是珍貴且來(lái)源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料。而二代測(cè)序的不斷發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用給臨床復(fù)雜疾病的基因診斷和治療帶來(lái)了新的曙光。FFPE樣本測(cè)序流程主要分為核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析、解讀四個(gè)部分。而提取的核酸的質(zhì)量對(duì)建庫(kù)的成功與否乃至下機(jī)數(shù)據(jù)的可靠性都起著重要的作用，因此對(duì)提取后核酸進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控就顯得尤為重要。

而目前傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法由于易受到雜質(zhì)，高級(jí)結(jié)構(gòu)等影響從而無(wú)法準(zhǔn)確的評(píng)估FFPE樣本的DNA有效濃度及完整性。

目前檢測(cè)DNA濃度的方法主要為分光光度計(jì)法和Qubit熒光劑法。分光光度計(jì)是利用核酸分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)(－C＝C一C＝C一)，能夠強(qiáng)烈吸收250-280nm波長(zhǎng)的紫外光；核酸(DNA/RNA)的最大紫外吸收值在260nm處；遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來(lái)測(cè)定核酸物質(zhì)的含量。盡管紫外吸收定量法是最常用的一種DNA定量方法，但其讀數(shù)并不可靠且不準(zhǔn)確。紫外吸光度法能夠檢測(cè)吸光度為260nm的所有物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、降解核酸和游離核苷酸。因此其無(wú)法準(zhǔn)確對(duì)FFPE樣本的有效DNA片段進(jìn)行定量。另一種常用的DNA定量?jī)x器2.0/3.0熒光計(jì)采用專(zhuān)門(mén)研制的熒光檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)采用只有與DNA結(jié)合后才發(fā)出熒光的分子染料；這些熒光染料只有與特異性的靶分子結(jié)合時(shí)，才能發(fā)出熒光信號(hào)，從而測(cè)定DNA濃度。但是其測(cè)定的濃度包含所有的DNA片段，包括降解的(如小于100bp)DNA片段。而這部分小片段對(duì)于DNA樣本的后期建庫(kù)是無(wú)意義的。Qubit熒光計(jì)定量受樣本雜質(zhì)的影響也較大。這兩種方法檢測(cè)的DNA濃度受DNA溶液中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的影響較大，因此定量不準(zhǔn)確。

目前檢測(cè)DNA完整性/降解程度使用較多的方法為瓊脂糖凝膠電泳及安捷倫2100生物分析儀(Aligent Bioanlyzer 2100)。瓊脂糖凝膠電泳是利用DNA片段遷移距離與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離進(jìn)行比較，得出未知片段的大小，進(jìn)而對(duì)FFPE樣本DNA的降解程度進(jìn)行檢測(cè)。但是該檢測(cè)方法受雜質(zhì)如蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)的影響較大，遷移率受到影響，從而無(wú)法準(zhǔn)確判斷其降解程度。而且該方法也不能對(duì)FFPE DNA樣本的降解程度進(jìn)行量化。Aligent Bioanlyzer 2100也存在著同樣的問(wèn)題，同時(shí)其儀器成本及檢測(cè)成本也比較高。

為了精確檢測(cè)FFPE樣本DNA的含量及完整性，并且將其成本降至最低，從而為建庫(kù)提供準(zhǔn)確的指導(dǎo)，避免樣本、時(shí)間、試劑、人力等成本的浪費(fèi)，亟待開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)FFPE樣本DNA的含量及完整性方法和產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)FFPE樣本DNA含量及完整性的方法，以精確檢測(cè)FFPE樣本DNA的含量及完整性。