[發(fā)明專利]一種利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)提高染料木素水溶性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710014828.6
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106754604A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓瑞枝;倪曄;姜明楊;葛彬彬;許國超;董晉軍
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/10;C12P19/18;C12P19/44;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開了一種利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)提高染料木素水溶性的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于大豆種子的子葉和胚軸中。其中，染料木素(又名金雀異黃素、染料木黃酮等)被認(rèn)為是大豆異黃酮類物質(zhì)中活性功能最高的一種。在豆科植物中，染料木素經(jīng)常以其葡萄糖苷衍生物即染料木苷(又名4',5,7-三羥異黃酮-7-糖苷)的形式存在。染料木素在人體及動物細(xì)胞中具有廣泛的藥理學(xué)功效。主要表現(xiàn)為：1)具有化學(xué)防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有類雌性激素及抗激素作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞合成過程中相關(guān)酶的活性，在腫瘤細(xì)胞形成過程中抑制腫瘤血管增生，延緩或阻止腫瘤變成癌細(xì)胞。2)可以預(yù)防心血管疾病。染料木素會激發(fā)低密度的脂蛋白受體產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用，同時可以促進膽固醇的清除，抑制血小板的凝集，對于動脈粥樣硬化等疾病具有預(yù)防和治療作用。3)可以預(yù)防絕經(jīng)后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能夠緩解婦女更年期綜合癥及預(yù)防絕經(jīng)后疾病。4)抗骨質(zhì)疏松作用。染料木素的雌激素活性能夠激活雌激素受體，提高成骨細(xì)胞活性；另外還可以增加骨密度，抑制骨量丟失，對骨質(zhì)疏松具有較好的改善作用。

然而，染料木素具有很強疏水性，幾乎不溶于水，在一般的有機溶媒中溶解度較差，而易溶于二甲基亞砜等有機溶劑。由于染料木素在水溶液中的溶解度極低，不僅限制了其作為食品添加劑、化妝品以及其他水溶性產(chǎn)品的應(yīng)用，而且也大大降低了其作為口服藥物及靜脈注射藥劑的藥用效果，限制了其醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成為目前國內(nèi)外關(guān)注的焦點。其中研究較多的是染料木素的糖基化衍生物。據(jù)報道雙葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分別是染料木素的3700倍和44000倍。糖基化染料木素相比與染料木素具有如下優(yōu)點：1)與染料木素具有相似的生理生化功能；2)在體內(nèi)水解為可被人體吸收的葡萄糖與染料木素，安全性較高；3)與染料木素相比水溶性明顯的改善，拓展了其的應(yīng)用范圍。因此，糖基化染料木素具有十分重要的應(yīng)用價值。目前常見的催化糖基化反應(yīng)的酶有β-糖苷酶(EC 3.2.1.120)，麥芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133)，4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.25)和環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.19)。我們將來源于Peanibacillus macerans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因cgt成功在Escherichia coli中異源表達(dá)，并采用密碼子優(yōu)化方法提高其表達(dá)量。該酶應(yīng)用于染料木素轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有較好的效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌。

所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans JFB 05-01，CCTCC NO：M208063)，并完成了密碼子優(yōu)化，基因序列如(GenBank accession no.JX412224)所示。

所述的產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌為本發(fā)明要求保護的范圍。該工程菌主要構(gòu)建過程如下：

1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；

2)將步驟1)獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接至大腸桿菌表達(dá)載體pET20b(+)，得到重組表達(dá)載體；

3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌。

所述的克隆、轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的分子操作方法。

本發(fā)明需要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)方法，主要步驟如下：

以產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后接種至含100μg/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；大腸桿菌在適當(dāng)溫度(30～37℃)振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在低溫(16～25℃)繼續(xù)振蕩培養(yǎng)一定時間(85～95h)后，低溫離心除去菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。經(jīng)硫酸銨鹽析，透析，以及鎳柱親和層析，獲得較純的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶并凍干備用。