[發明專利]一種固定化核酸酶P1及其制備方法與其應用

有效

• 申請號: 201710012814.0
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106591274B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發明（設計）人: 應漢杰;黃金莎;莊偉;吳菁嵐;周精衛;陳勇;陳曉春;朱晨杰;柳東;牛歡青
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12N9/22;C12P19/30
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 丁靜靜;肖明芳

1.一種固定化核酸酶P₁的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）改性樹脂：以表面修飾劑改性介孔樹脂，得到表面改性的介孔樹脂載體；

其中，所述的表面改性劑為伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一種或幾種的混合物；

所述的介孔樹脂為環氧基樹脂、氨基樹脂、磺酸基樹脂或者羧基化樹脂；

（2）核酸酶P₁固定化：將步驟（1）得到的介孔樹脂載體加入到0.5～6g/L核酸酶P₁酶液中，核酸酶P₁與樹脂的質量比為5～20mg：lg，混合，在25℃振蕩反應時間2～12h，抽濾得到樹脂固定化核酸酶P₁；

步驟（1）中，利用伴刀豆蛋白改性介孔樹脂的方法如下：

（1a）伴刀豆蛋白活化：將伴刀豆蛋白溶于緩沖液中，所述的緩沖液包括如下組分：

0.1mol/L KC1、0.01mol/LCaC1₂、0.01mol/ L MnC1₂、0.1mol/L KH₂PO₄、0.1mol/LK₂HPO₄，pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；

（1b）戊二醛活化介孔樹脂：將50~200g介孔樹脂加入成二醛溶液中，所述的戊二醛溶液為戊二醛質量分數為2%的0.1mol/L，pH8.0的磷酸緩沖液，攪拌15~60min，得到戊二醛活化的介孔樹脂；

（1c）伴刀豆蛋白修飾介孔樹脂：將戊二醛活化的介孔樹脂加入伴刀豆蛋白溶液中，在25℃、150rmp下震蕩6~18h，去除上清，水洗介孔樹脂，得到伴刀豆蛋白修飾的介孔樹脂；

步驟（1）中，利用聚乙二醇、聚多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮改性介孔樹脂的方法如下：

（2a）配制改性劑溶液：0.05~5g/L聚乙二醇溶液、0.1~3g/L鹽酸多巴胺Tris溶液、1~5g/L聚乙烯吡咯烷酮溶液；

（2b）取1~5g介孔樹脂于反應容器中，加入50～300mL相應的改性劑溶液，置于25℃、120~180rmp恒溫搖床中震蕩，去除上清，水洗介孔樹脂，得到改性的介孔樹脂。

2.根據權利要求1所述的固定化核酸酶P₁的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述的核酸酶P1的氨基酸序列如 SEQ ID NO．：1所示。

3.權利要求1～2任一所述固定化核酸酶P₁的制備方法制備得到的樹脂固定化核酸酶P1。

4.權利要求3所述樹脂固定化核酸酶P₁在水解RNA制備核苷酸中的應用。