[發明專利]一種熊去氧膽酸的制備方法及其制備用酶

有效

• 申請號: 201710012364.5
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106636285B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 傅榮昭;劉立輝;劉滔滔;曹磊
• 申請（專利權）人: 眉山市新功生物科技有限公司;邦泰生物工程（深圳）有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N9/04
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所51213
• 代理人: 李靜云

技術領域

本發明涉及分子生物學與生物技術領域，特別涉及一種利用生物酶催化技術制備熊去氧膽酸的方法及其制備用7β-類固醇脫氫酶。

背景技術

熊去氧膽酸是名貴中藥熊膽的主要有效成分，具有增加膽汁酸分泌、并使膽汁成分改變、有利于膽結石中的膽固醇逐漸溶解、降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂等功效，主要用于治療膽石疾病。眾所周知，熊膽是一種非常稀缺的資源，原因在于其獲取的傳統途徑主要是依賴于人工養殖活熊取膽的方法。目前，這種周期長、收率低且不人道的傳統途徑逐漸被人工合成方法所取代。

起初，熊去氧膽酸的人工合成方法多為化學法，并且被廣泛應用于工業生產中。但是化學法存在操作條件苛刻、選擇性低、污染環境、使用大量有機溶劑、存在有機溶劑殘留、有毒有害等缺點。為了解決化學法存在的諸多缺點，人們另辟蹊徑，尋找更好的生產途徑。中國發明專利申請CN105368828A公開了一種采用全細胞催化制備3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸熊去氧膽酸的方法，但是此種方法需進行細胞發酵培養，存在反應時間長、操作繁瑣、產物復雜等缺點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種熊去氧膽酸的新的制備方法，以解決上述背景技術中提到的現有制備方法所存在的有機溶劑殘留、條件苛刻、反應時間長、操作繁瑣、污染環境等缺點，本發明同時提供了該新制備方法適用的生物酶。

為實現上述目的，發明人經過長期大量的實驗摸索，在經歷上百次的失敗嘗試之后，終于篩選出適用于細胞外生物催化制備熊去氧膽酸的生物酶，并在此序列基礎上進行優化，獲得了活性提高和去除底物抑制的突變體酶，從而開發出一種新的制備熊去氧膽酸的方法，其特征在于：以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脫氫酶以及緩沖溶液存在的條件下，用7β-類固醇脫氫酶催化3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸制備熊去氧膽酸，所述7β-類固醇脫氫酶來源于Turneriella parva，所述葡萄糖脫氫酶來源于巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium，其基因序列如SEQ ID NO：3所示，在整個催化反應體系中，所述底物的濃度為50～100mg/mL，所述NADP的濃度為0. 1～0.25mg/mL，所述葡萄糖的濃度為30～50mg/mL。

上述方法中所使用的兩種酶的具體存在形式包括液態酶液、固態以及各種固定化酶，可以是未經純化的粗酶形式，也可以是經部分純化或完全純化的形式。

優選地，控制所述催化過程在溫度為25～35℃，pH值為7.5～8.5的條件下進行。

優選地，所述緩沖溶液為50～100mM磷酸鉀緩沖液。

優選地，上述制備方法還包括如下提純步驟：待所述催化過程反應結束后，調節pH值為10.5～12.5，除去不溶物，再調節pH值為1.0～2.0，水浴50-60℃，攪拌20～30min，待冷卻后過濾、經水洗三次后真空干燥即得熊去氧膽酸的成品。

更優選地，上述制備方法還包括如下精制步驟：將獲得的熊去氧膽酸的成品用10-20倍無水乙醇50-60℃水浴條件下攪拌回流0.5-1h，熱過濾，取濾液進行真空減壓濃縮至1/4-1/5體積，再加入5-10倍純水攪拌1h進行結晶，過濾，將濾餅真空干燥，即得熊去氧膽酸的精制品。

優選地，上述制備方法中所使用的7β-類固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白質，

（b）在（a）限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸并且在NADP存在下以3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸為底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的親本高的7β-類固醇脫氫酶催化活性的由（a）衍生的蛋白質。

更優選地，所述7β-類固醇脫氫酶與如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比在選自至少一個下述位點處具有至少一個突變：第15位、第16位、第38位、第39位、第154位、第158位、第193位、以及第195位。

更優選地，所述7β-類固醇脫氫酶具有至少一個下述突變：G15A、S16K、V38R、V39R、Y154W、K158E、R193Q以及A195I。

本發明還提供了一種7β-類固醇脫氫酶，其特征在于：所述7β-類固醇脫氫酶來源于Turneriella parva，用于催化3α-羥基-7氧代-5β-膽烷酸制備熊去氧膽酸，所述7β-類固醇脫氫酶為如下（a）或（b）的蛋白質：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白質，