[發明專利]一種體內檢測CART細胞表達的技術及其用途在審
| 申請號： | 201710012270.8 | 申請日： | 2017-01-09 |
| 公開（公告）號： | CN108285920A | 公開（公告）日： | 2018-07-17 |
| 發明（設計）人： | 黃飛;金濤;王海鷹;何鳳;史子嘯 | 申請（專利權）人： | 上海恒潤達生生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 201210 上海市浦東新*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 標準品 基因組 細胞 體內表達 轉染 全基因組DNA 熒光定量PCR 標準曲線 表達效率 病毒拷貝 技術檢測 聯合應用 梯度稀釋 體內檢測 細胞表達 細胞整合 線性關系 內參 質粒 檢測 | ||
1.一種用于檢測CART轉導效率的引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為：GGGTTCCAAGCCGATTCAGT，即SEQ ID NO：5；所述下游引物的序列為：CAAGTTGCTAATGGTCAGGGAATA，即SEQ ID NO：6。
2.一種與權利要求1所述的引物配合內參序列，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為：GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG，即SEQ ID NO：7；所述下游引物的序列為：GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT，即SEQ ID NO：8。
3.一種用于外周血中檢測CART表達效率的方法，其特征在于：包括如下步驟：
1)DNA模板的制作：無菌環境中，取培養后的CART細胞，提取DNA；
2)系列標準品的制作：使用CAR的質粒作為標準品，提取感染前T淋巴細胞DNA，用來稀釋CAR的質粒，制成標準品1；使用已知表達量的CART細胞，提取感染前T淋巴細胞DNA，用來稀釋已知表達量的CART細胞，制成標準品2；使用感染前T淋巴細胞DNA基因組，測內參CDKN1A，制成標準品3；
3)Real-Time PCR檢測：配制反應體系，該反應體系包括權利要求1所述的引物以及，對DNA模板進行Real-Time PCR擴增反應，收集熒光信號，繪制標準曲線，得出CART基因拷貝數和CART轉導效率。
4.根據權利要求3所述的體內檢測CART表達的方法，其特征在于，在構建標準品過程中，CART細胞的靶點基因為CD19。
5.根據權利要求1所述的體內檢測CART表達的方法，其特征在于，在待測樣本處理過程中，樣本包括患者的全血和/或骨髓和/或腫瘤組織。
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