[發(fā)明專利]一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710009219.1
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106636243A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李欣航;張金龍;楊盼盼;海陶;蔣麗剛;李文倩;陳偉
• 申請（專利權(quán)）人: 珀萊雅化妝品股份有限公司
• 主分類號: C12P17/04
• 分類號: C12P17/04;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 杭州千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司33246
• 代理人: 黎雙華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體提取物的方法。

背景技術(shù)

白藜蘆醇二聚體(viniferins)是白藜蘆醇被4-羥基芪過氧化物酶(4-trihydroxy-trans-stilbene)氧化所形成的；是植物在惡劣環(huán)境中或遭到病原體侵染時所分泌的植物抗毒素；比白藜蘆醇具有更強(qiáng)的抗氧化性能，能夠有效清除和抑制自由基的產(chǎn)生，同時還能抑制脂質(zhì)過氧化和DNA損失；可改善血小板的活性達(dá)到舒緩過敏癥狀和抗炎的作用。

白藜蘆醇二聚體存在于葡萄葉表皮、漿果果皮和葡萄籽中，含量極低。雖然采取如紫外線照射、真菌感染、機(jī)械損傷等方法會刺激白藜蘆醇二聚體的合成，但效果不佳。當(dāng)前對白藜蘆醇二聚體的制備方法主要是化學(xué)全合成法，有研究應(yīng)用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)處理白藜蘆醇，合成白藜蘆醇二聚體，產(chǎn)量為15％，缺點(diǎn)是合成產(chǎn)率低，應(yīng)用大量強(qiáng)刺激性、有毒的DPPH，危險性高、環(huán)境負(fù)荷重；有研究應(yīng)用FeCl₃處理白藜蘆醇，得到白藜蘆醇二聚體，產(chǎn)量為2.7％，缺點(diǎn)是重金屬富集，難以直接應(yīng)用；有研究應(yīng)用白藜蘆醇化學(xué)氧化聚合產(chǎn)生白藜蘆醇二聚體，缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜，副產(chǎn)物多，且反應(yīng)方向不可控。

目前國內(nèi)外尚未有應(yīng)用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，也未有應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶蛋白的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，以解決當(dāng)前白藜蘆醇二聚體產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜、反應(yīng)方向不可控、環(huán)境負(fù)荷重的問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質(zhì)粒載體的構(gòu)建：分別應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoP1和EcoP15酶切4-羥基芪過氧化物酶基因片段和pPU19質(zhì)粒，得到酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質(zhì)?；蚱蝡PU19(+)；采用T4連接酶將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPU19-4TTS，然后通過PCR技術(shù)擴(kuò)增以pPU19質(zhì)粒DNA為PCR擴(kuò)增模板的4-羥基芪過氧化物酶基因，得PCR擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pPU19-4TTS；所述4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC；

2)通過熱激法將PCR擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒表達(dá)載體pPU19-4TTS轉(zhuǎn)入保藏編號為638632的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌株中，獲得表達(dá)4-羥基芪過氧化物酶的畢赤酵母，命名為Pichia pastoris/pPU19/4TTS，其核苷酸序列：