[發明專利]一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法

在審

• 申請號: 201710009219.1
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106636243A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 李欣航;張金龍;楊盼盼;海陶;蔣麗剛;李文倩;陳偉
• 申請（專利權）人: 珀萊雅化妝品股份有限公司
• 主分類號: C12P17/04
• 分類號: C12P17/04;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司33246
• 代理人: 黎雙華

1.一種采用畢赤酵母制備白藜蘆醇二聚體的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)含4-羥基芪過氧化物酶基因的pPU19質粒載體的構建：分別應用限制性內切酶EcoP1和EcoP15酶切4-羥基芪過氧化物酶基因片段和pPU19質粒，得到酶切后的4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)和pPU19質粒基因片段pPU19(+)；采用T4連接酶將上述酶切產物進行連接，得到重組質粒pPU19-4TTS，然后通過PCR技術擴增以pPU19質粒DNA為PCR擴增模板的4-羥基芪過氧化物酶基因，得PCR擴增后的重組質粒表達載體pPU19-4TTS；所述4-羥基芪過氧化物酶基因片段4TTS(+)的基因序列為：

GAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCAC；

2)通過熱激法將PCR擴增后的重組質粒表達載體pPU19-4TTS轉入保藏編號為638632的Komagataella pastoris DSMZ 70382畢赤酵母菌株中，獲得表達4-羥基芪過氧化物酶的畢赤酵母，命名為Pichia pastoris/pPU19/4TTS，其核苷酸序列：

TCGCTGGTAATCCCGGCTTTTGCTGCTTACAAGCTTTACGGATTATTTCTAGGAGGTAGNCAATTATTGGGTGGTCGCAGCAGTTTCAAAGAGGAGGAGCCAGCTTCTGGGTCAAAAGAAAAGGGACAGAGCAAGAGACAACAGAAACTAGAAAAGAGAGGACAAAAGGTGAGATACAGATAGAATCTTTGCGAGTGAACCAAGGTAGCTGAAAAACATAACTTGCAAGGATGCTATTGGACAATTTTAGGTGATAAACTCGATTGCTATCACTGGGCTCTGCCACATGGAAGCTTTAGTGAGAAGAGCTGTCGACAGTCGCATGCCAGCTAAATTAAGAAAACCTTCACTTGCTTCAAGTAAAGCATGTCGATCCTTCAACGAATTCTATATCACTTGGATGGAAAACTAAGTGTTCAGTATTTCACAGGTGACAAACCAGACAAGAAGCGTACATTCATTTGACCGAAGAAGCTTGAGGAGCACCCAAACATGGTGCTTATATGGCTCCATCTCTTAACACGCCAAGAGATCACAGCTCTTGCGCACTATTCGAGTCGTTTACTTTTTTTTTGGTTTTTGCTAGGCCTTCCATTACTTCTTTACTTCGTTAGTGACAAGTGACTTAAGGCCAATGTATTCTTGAATCAAAAGAAGGCTGTGTCAATTCCTAAGCCCTACTAGCTCTACTTTCGGAGTGACCTACCGATAAGTTCGCATACGCGAATCTGGACCATTTTTATAATACCAAGTAGAAATTCAATAGCCATCTAGCTGTTTCTACATGATGACAGCCCATAACCATAAAGAAAACTGCAAACGATTGCTGAGCTTGTAGAGCGTCCAGTAAGTAGCGCAATCTCCAGTGAGCAACGTAATATCATATTTTCTTCTCTCTCTTTCATTCTCCTCCGAGAATTACAGAAGCATCATAGTAGTGTACCCACCAATGGTTGTGAGCGACTGCGCGATTCCATGGATGCTACTGAAACCAATGAATGAAACTTGTCAAGTTTCCTCGCTTCCTTTTACATAACGGATCTTTTAACTTAGAAACAGTTTAGTAAAAGAAATTCATCAATACAATGGACGGAGGTAAGTCAGCTCTTTCAGCAAGGGAGCATGGAATCAGATTGGCAACGACTTCTGCGATTCTTATTCTTCCGATTGATTCAACAGTAGATTTGCGAGTGGTTGGCCAAACACACAGTTTCGATGCGATCTCCGTTTGATTTGTATGAATACGCAGTCATCTCATTGGTGGAGCATTTTATACGGATTGATTGAGTGGAAGCATGGTACTGAGAGTATCTACATGTGCATTTCTGTTGGTTGTCCTCGGTTGAGTTTTCGTATCTGTTTGTCCCCCCAATTTTGTCCACTCCTTTTGGCAATCTGCCGAATCCAAGCTCATAATACTAACTCCCATTTTAGAAGACGTTGCAGCAGTAAGTACCCTTACATGTAATCCATGAAAGCAAATGTGGCGCAGTCAATCGAAGTCACTGTCTGATTGATTCTTCCCTCAGTGGCGGT；

3)對步驟(2)得到的Pichia pastoris/pPU19/4TTS菌株通過劃線和繼代培養，經初篩、復篩，進行液培發酵，選取代謝產物含量高或是活性高的菌液劃線于固體篩選培養基上，分離純化，得到復篩菌種；

4)制備含白藜蘆醇二聚體的發酵產物：配置含有15-20g/L的白藜蘆醇的LB發酵培養基，從平板上挑取Pichia pastoris/pPU19/4TTS單菌落于LB培養基的搖瓶中，發酵，得到含白藜蘆醇二聚體的發酵產物；

5)白藜蘆醇二聚體的分離：將步驟(4)所述含白藜蘆醇二聚體的發酵產物液體經樹脂純化，得固型物即為白藜蘆醇二聚體提取物。