[發(fā)明專利]一種用于抗生素檢測的磁控適配體傳感器制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710007605.7
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106770173B
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李歡歡;陳全勝;趙杰文;歐陽琴;郭志明;林顥;劉妍;孫浩;楊明秀
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于抗生素殘留檢測的MCNCs/PMAA磁控拉曼適配體傳感器制備方法，其特征在于，該方法包括如下具體步驟：

1)MCNCs/PMAA磁性納米微球制備：利用溶劑熱法合成MCNCs，首先，稱取1.350g FeCl₃·6H₂O，3.854g醋酸鈉，0.400g檸檬酸鈉溶解在裝有70mL乙二醇的250mL三口圓底燒瓶中，隨后，上述溶液在氬氣保護下加熱到300℃，并持續(xù)反應(yīng)1h，形成均勻的黑紅色溶液；待溶液冷卻至室溫，將其轉(zhuǎn)移到至100mL聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜中，在200℃下密封、加熱反應(yīng)17小時；最后，通過磁分離收集的方法，以乙醇和超純水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色MCNCs納米微球待用；隨后在MCNCs表面修飾PMAA殼，修飾之前，首先在其表面修飾改性聚苯乙烯MPS，具體操作步驟為，將40mL乙醇、10mL超純水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL MCNCs乙醇溶液中，并在60℃水浴環(huán)境下磁力震蕩反應(yīng)24h；最后，利用蒸餾沉淀聚合法以甲基丙烯酸AA、甲叉雙丙烯酰胺MBA作為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈AIBN為引發(fā)劑，在乙腈溶劑中制備MCNCs/PMAA磁性納米微球；

2)MCNCs/PMAA-適配體捕捉探針制備：具有羧基表面的MCNCs/PMAA磁性納米微球和具有氨基表面的核酸適配體利用縮合反應(yīng)制備得到MCNCs/PMAA-適配體螯合物；具體操作步驟為：取1mL羧基化的MCNCs/PMAA分散至2mL EDC水溶液中，隨后，將含有1mL 1μM核酸適配體的PBS溶液加入至上述溶液中混合反應(yīng)12h，最終得到MCNCs/PMAA-適配體捕捉探針；

3)增強基底APS制備：將制備的金納米顆粒與對巰基苯胺PATP乙醇溶液室溫下反應(yīng)約4h，得到Au/PATP；隨后，將APTMS逐滴加入混合溶液中，反應(yīng)15min后，將5mL硅酸鈉加入溶液中，在90℃水浴環(huán)境下反應(yīng)30min，得到增強基底待用；

4)信號分子cDNA-APS制備：攪拌15分鐘后，將增強基底進行離心分離，棄上層液體，獲得的沉淀用乙醇和乙腈分別清洗三次，在60℃下干燥1h，隨后與溶解在乙腈溶劑中的三聚氯氰連續(xù)攪拌反應(yīng)4h；此后，將產(chǎn)物進行離心，棄上層液體，獲得的沉淀用乙腈、超純水、硼酸鹽緩沖液BBS分別清洗3次；最終產(chǎn)物再分散在BBS溶液中，將0.4mL cDNA BBS溶液加入其中，室溫下輕微震動連續(xù)反應(yīng)過夜；

5)基于拉曼光譜的四環(huán)素殘留檢測：首先，將制備的MCNCs/PMAA-aptamer捕捉探針與cDNA-APS信號分子混合，37℃下連續(xù)震蕩反應(yīng)2h；隨后,分別取200μL MCNCs/PMAA-aptamer/cDNA-APS生物螯合物分裝至一系列平行離心管中，隨后，將100μL不同濃度的待檢物抗生素原液依次加入到上述離心管中，混合溶液37℃條件下連續(xù)震蕩反應(yīng)70min；以加有100μL超純水的離心管作為對照組；反應(yīng)結(jié)束后，利用磁鐵進行MCNCs/PMAA-aptamer-抗生素磁性富集，同時利用拉曼光譜在150cm^-1-2000cm^-1波長范圍內(nèi)對含有不同濃度信號分子的上清液拉曼強度進行測定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于抗生素殘留檢測的MCNCs/PMAA磁控拉曼適配體傳感器制備方法，其特征在于，所述的MCNCs/PMAA納米微球，由蒸餾沉淀聚合反應(yīng)制備而成，具有高飽和磁化強度71.5emu/g及優(yōu)良的生物相容性，有利于快速、較易的生物反應(yīng)及磁性分離；此外，該納米微球具有自由的羧基表面，使其盡可能多的與核酸適配體發(fā)生縮合反應(yīng)生成捕捉探針。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于抗生素殘留檢測的MCNCs/PMAA磁控拉曼適配體傳感器制備方法，其特征在于，所述的抗生素為四環(huán)素，核酸適配體序列為：5’-NH₂-CGT ACGGAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATCCGA GCT CCA CGT G-NH₂-3’，核酸適配體短鏈互補DNA為：5’-NH₂-CAA CGT GCT AGC GAA-3’。