[發明專利]一種支原體污染的處理方法

在審

• 申請號: 201710006948.1
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106635950A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 高毅;傅超毅;李陽;彭青
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學珠江醫院
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京市立方律師事務所11330
• 代理人: 劉延喜,王增鑫

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種支原體污染的處理方法。

背景技術

在細胞培養技術是一種體外增殖細胞的常規實驗技術，目前被廣泛用于教學、科研和臨床實驗。污染控制是細胞培養能否成功的關鍵所在。引起培養細胞污染的微生物有細菌、霉菌、黑膠蟲、支原體等，其中支原體是常見的污染物。

支原體在體型上比細菌和真菌小，一般的光學顯微鏡并不能觀察到其存在，且受到支原體污染的細胞有相當一部分仍然可以生長增殖，因此支原體污染相較于細菌和真菌的污染并不容易發現。被支原體污染的細胞，不可避免的會在細胞代謝和功能發生改變，從而影響利用污染細胞進行實驗的結果，同時也是生物制品的一個安全隱患。

目前，培養的細胞一旦發生支原體污染，大多的解決方式是滅活后丟棄，但是如果細胞是非常珍貴無法替代的，這種方法就不能使用了。

發明內容

鑒于上述問題，本發明提出了一種支原體污染的處理方法實現在不滅活后丟棄的前提下清除支原體污染的目的，本發明采用如下技術方案：

提供一種支原體污染的處理方法，包括以下步驟：

(1)獲取待處理的細胞；

(2)用含10ug/mL環丙沙星的培養基培養所述待處理的細胞；

(3)定時更新所述培養基，并且使所述待處理的細胞的生長密度保持在50％-80％；

(4)檢測不到支原體污染的情況之后停止使用所述培養基。

優選地，所述定時更新所述培養基的方法采用如下任意一種：

每隔固定天數更新所述培養基；

每當所述細胞的生長密度達到所述第一預設密度時，更新所述培養基。

優選地，所述第一預設密度為75％-85％。

優選地，所述使所述細胞生長密度保持在50％-80％通過如下步驟：

檢測所述待處理的細胞的生長密度；

使用胰酶消化并棄去多余的細胞；

用新的所述培養基繼續培養。

優選地，所述檢測不到支原體污染的情況之后停止使用所述培養基為通過PCR檢測不到支原體的DNA的存在時停止使用所述培養基。

優選地，所述檢測不到支原體污染的情況之后停止使用所述培養基為當所述待處理的細胞處理時長超過兩周之后停止使用所述培養基。

優選地，所述培養基為含20％胎牛血清的DMEM培養基。

優選地，所述待處理的細胞的獲取方法包括如下步驟：

在培養瓶中培養支原體污染的細胞至第二預設密度，舍棄上清液，使用磷酸緩沖溶液洗滌兩次；

使用胰蛋白酶溶液進行消化；

用新鮮的基礎培養基終止消化，并重懸細胞，得到所述待處理的細胞。

優選地，所述第二預設密度為75％-85％。

優選地，所述消化過程在預設條件下進行，所述預設條件為：溫度37℃、CO₂濃度5％。

優選地，所述新鮮的基礎培養基為含20％胎牛血清的DMEM培養基。

與現有技術相比，該發明一種支原體污染的處理方法具有如下有益效果：

本發明一種支原體污染的處理方法采用在培養基中添加環丙沙星的方法去除支原體，達到了在對細胞的影響小情況下，即并不是采用先滅活后丟棄方式，徹底清除支原體污染的目的，同時還具有停止使用環丙沙星后不復發的優勢，在一定程度上提高了非常珍貴的無法替代的細胞生存能力，便于人們的研究。

本發明一種支原體污染的處理方法采用環丙沙星材料具有簡單易取，成本低廉的優勢，降低了本發明的應用門檻，同時便于本發明的推廣應用。

本發明一種支原體污染的處理方法具有操作簡單，步驟少、時間短的特點，在一定程度上提高了人們的生產效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法流程圖；

圖2示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法的PCR檢測支原體的DNA電泳示意圖；

圖3示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法的環丙沙星處理一周的HepGL細胞光鏡圖；

圖4示出了本發明一個實施例一種支原體污染的處理方法的停止使用含10ug/mL環丙沙星的培養基的兩周后的HepGL細胞光鏡圖。