[發明專利]一種氧化酶及其應用

有效

• 申請號: 201710006510.3
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106701701B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 蔡宇杰;武旭攀;曹憬;白亞軍;鄭曉暉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12P7/62;C12P41/00
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明涉及一種來源于斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)的D?乳酸氧化酶基因的獲得及其克隆表達，屬于生物工程領域。公開了其底物特異性，同時該D?乳酸氧化酶可以氧化(R)?α?羥酸酯，可應用于光學純(S)?α?羥酸酯的制備。

技術領域

本發明克隆表達了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。

背景技術

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)。

目前為止，已經在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發現了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,BringerMeyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for abranched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)。

本發明首次從斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應相比逆反應極微弱，可應用于光學純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。

發明內容

本發明從斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartii)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。

本發明的技術方案如下：

1、菌株

本發明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Providencia stuartii ATCC 49809，購自美國ATCC菌種庫。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Providencia stuartii ATCC 49809菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。

3、D-乳酸氧化酶表達與純化

將重組質粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、D-乳酸氧化酶的酶學性質分析

以D-乳酸為底物研究pH對本發明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

以D-乳酸為底物研究溫度對本發明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。

酶活測定方法為：根據Characterization of a Lactate Oxidase from aStrain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry andBiotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯