[發明專利]在經修飾的酵母中生產甾醇

有效

• 申請號: 201680082413.6
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN109154015B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 漢斯-彼得·霍曼;雷吉納·萊伯;馬丁·萊瑪恩;科琳娜·奧達爾;芭芭拉·佩特斯查徹爾;哈拉德·皮希勒;比吉特·普羅爾
• 申請（專利權）人: 帝斯曼知識產權資產管理有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N9/10
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258
• 代理人: 肖善強

本發明涉及在經修飾的酵母細胞中生產甾醇混合物，其中通過修飾所述酵母中的甾醇酰基轉移酶活性，所述混合物中存在的酵母甾醇的量被顯著降低或消除。經修飾的酵母細胞可用于生產維生素D3或其衍生物和/或其代謝物。

本發明涉及在經修飾的酵母細胞中生產甾醇混合物，其中通過修飾所述酵母中的甾醇酰基轉移酶活性，所述混合物中存在的酵母甾醇的量被顯著降低或消除。經修飾的酵母細胞可用于生產維生素D3或其衍生物和/或其代謝物。

維生素D3(又名膽鈣化醇或calciol)可以在哺乳動物的皮膚中從原維生素D3(又名7-脫氫膽甾醇或7-DHC)合成，原維生素D3是暴露于紫外光時膽甾醇生物合成的產物，其中7-DHC被光化學轉變為原維生素D3，原維生素D3在體溫下異構化為生物活性形式的維生素D3。在肝臟中，維生素D3被轉變為無生物活性的25-羥基維生素D3(又名骨化二醇(calcidiol、calcifediol)、25-羥基膽鈣化醇，25-OH-D3或HyD)，其是維生素D3的主要循環形式。進一步的羥基化發生在腎臟中。

對于維生素D3的工業生產，化學合成和生物技術合成(原則上)都是可用的。化學合成始于從例如羊毛脂中分離的膽甾醇，膽甾醇被脫氫成7-DHC，然后進行紫外光照射和進一步的純化/提取步驟，從而導致維生素D3。或者，經修飾的酵母菌株可被用于產生維生素D3前體，維生素D3前體可被分離并進一步轉變為維生素D3。過量的甾醇(例如維生素D3前體，包括7-DHC)儲存在細胞內細胞器(所謂的脂滴)中，并可從中被進一步分離。游離甾醇(包括維生素D3前體)與儲存在脂滴中的甾醇(呈甾醇或甾醇酯形式)之間的平衡是通過幾種蛋白質(特別是酶，包括甾醇酰基轉移酶)的作用觸發的。

通常，酵母或其它真菌細胞不適合維生素D3生產，原因在于：首先，從乙酰CoA開始，酵母和其它真菌所產生的天然主要甾醇是麥角甾醇而非膽甾醇。通過在編碼ERG5和ERG6的基因中引入雙重敲除已避開了這一瓶頸，導致膽甾-5，7，24(25)-三烯醇和酵母甾醇以幾乎相等的量產生，并且這種erg5erg6雙重敲除菌株僅最少量產生麥角甾醇。

然而，這導致了另一瓶頸：僅膽甾-5,7,24(25)-三烯醇能被用作維生素D3前體，而酵母甾醇不能被用作維生素D3前體。三烯醇是7-DHC的直接前體，7-DHC可用于維生素D3生產。其它甾醇通路中間體如酵母甾醇的積累對于這種生產過程沒有幫助，并且會在許多方面(產率、下游加工等)對生產過程有負面影響。

因此，持續進行的任務是生成適于生產維生素D3前體的宿主細胞，例如酵母細胞，即產生膽甾-5,7,24(25)-三烯醇的宿主細胞，其中膽甾-5,7,24(25)-三烯醇與酵母甾醇之間的平衡轉向膽甾-5,7,24(25)-三烯醇，預計這還會導致由這種酵母菌株產生的維生素D3前體(例如7-DHC)的量增加，維生素D3前體被進一步轉變為維生素D3和/或其衍生物或代謝物。特定的代謝物(也是本發明的焦點)是25-羥基維生素D3。

出乎意料地，我們現在發現：通過下述方法，產膽甾醇的酵母細胞內總甾醇的組成可以顯著改變，即產物比例可以轉向膽甾-5,7,24(25)-三烯醇和/或7-DHC，而非待儲存在脂滴中的酵母甾醇：降低或消除此類酵母菌株中存在的某些甾醇酰基轉移酶的活性，并任選地向此類酵母細胞中引入異源甾醇-O-酰基轉移酶(HAT)。

特別地，已發現：通過減少或消除產膽甾醇的酵母中甾醇酰基轉移酶同種型Are2p的活性，酵母甾醇的量可被幾乎消除(基于酵母甾醇的總量)，朝向膽甾-5,7,24(25)-三烯醇(作為甾醇化合物存在于脂滴中)強烈增加。在進一步操作之后，此類菌株可被用于生產維生素D3前體，例如7-DHC。